Signal-til-støj-forholdet mellem data er en af de vigtigste overvejelser i udførelsen af X-ray diffraktion målinger fra mikrokrystaller. VMXm-beamline giver et støjsvagt miljø og mikrobjælke til sådanne eksperimenter. Her beskriver vi prøveforberedelsesmetoder til montering og afkøling af mikrokrystaller til VMXm og andre mikrofokus makromolekylær krystallografistrålelinjer.
Montering af mikrokrystaller (<10 μm) til enkelt krystal kryo-krystallografi udgør en ikke-triviel udfordring. Forbedringer i datakvaliteten er set for mikrokrystaller med udvikling af beamline optik, stråle stabilitet og variabel stråle størrelse fokus fra submicron til mikron, såsom på VMXm beamline på Diamond Light Source1. Der vil blive opnået yderligere forbedringer af datakvaliteten gennem forbedringer af stikprøvemiljøet og prøveforberedelse. Mikrokrystaller i sagens natur generere svagere diffraktion, derfor forbedre signal-til-støj er nøglen til at indsamle kvalitet X-ray diffraktion data og vil overvejende komme fra reduktioner i baggrundsstøj. Større kilder til røntgen baggrundsstøj i et diffraktionseksperiment er fra deres interaktion med luftvejen før og efter prøven, overskydende krystalliseringsopløsning omkring prøven, tilstedeværelsen af krystallinsk is og scatter fra enhver anden stråleinstrumentering eller røntgenvinduer. VMXm-beamlinen omfatter instrumentering og en protokol til forberedelse af prøver for at reducere alle disse støjkilder.
For det første fjerner et in-vacuum prøvemiljø ved VMXm luftvejen mellem røntgenkilde og prøve. Dernæst bruger prøveforberedelsesprotokoller til makromolekoøg krystallografi ved VMXm en række processer og værktøjer tilpasset fra kryoTEM. Disse omfatter kobbergitre med holey carbon støtte film, automatiseret blotting og springet køling robotteknologi gør brug af flydende ethan. Disse værktøjer gør det muligt at forberede hundredvis af mikrokrystaller på et enkelt kryoTEM-gitter med minimal omgivende væske på en støjsvag støtte. De minimerer også dannelsen af krystallinsk is fra enhver resterende væske omkring krystallerne.
Vi præsenterer processen til fremstilling og vurdering af kvaliteten af opløselige proteinmikrokrystaller ved hjælp af synligt lys og scanning af elektronmikroskopi, før prøverne monteres på VMXm-strålelinjen til røntgen diffraktionsforsøg. Vi vil også give eksempler på eksempler på god kvalitet prøver samt dem, der kræver yderligere optimering og strategier til at gøre det.
En stor barriere for bestemmelse af højopløselige strukturer af biologiske molekyler ved makromolekylær krystallografi (MX) er fortsat produktionen af godt diffrakerende krystaller i en modtagelig størrelse. Der er mange strategier for at nå dette mål fra rekombinant protein gen konstruere design gennem store sparsomme matrix søgninger efter kemiske cocktails, der kan generere indledende krystaller2. For sidstnævnte er det ofte sådan, at krystallographeren bliver nødt til at optimere eventuelle indledende hits for at opnå krystaller med tilstrækkelig diffraktionskvalitet og størrelse til strukturbestemmelsesundersøgelser3. På trods af disse muligheder kan nogle målmolekyler aldrig generere store (>10 μm), godt diffrakerende krystaller, og som følge heraf skal krystallographeren fortsætte med deres mikrokrystaller og de udfordringer, som sådanne prøver præsenterer. Disse omfatter passende montering og kryo-beskytte krystaller, styring i sagens natur svagere diffraktion og øget stråling følsomhed. Mikrokrystaller dannes af færre enhedsceller og molekyler end større krystaller, og som sådan forstærkes diffraktionen ikke i samme omfang sammenlignet med større krystaller, hvilket resulterer i i sagens natur svagere diffraktionsintensiteter. Det er vigtigt, at baggrundssignalet ikke maskerer disse refleksioner, især ved højere opløsning, hvor svage refleksionsintensiteter kan gå tabt4. Derudover er mikrokrystaller mere følsomme over for strålingsskader, og på trods af registrering diffraktion ved flydende nitrogentemperaturer5, er det muligvis ikke muligt at indsamle komplette data fra en enkelt krystal, hvilket gør det nødvendigt at indsamle data fra et meget stort antal krystaller for at producere et enkelt komplet datasæt6.
Den stigende tilgængelighed af røntgenfri elektronlasere (XFELs) og udviklingen af seriel krystallografi metoder (SFX)7 har givet ruter til indsamling af data fra mindre mikrokrystaller. Der er dog tale om skræddersyede prøveleveringsmetoder, som kræver en betydelig mængde hardware- og softwareekspertise, hvor eksperimenter er begrænset til stuetemperatur og typisk er et prøveforbrug højt (hundredvis af mikroliters) og stadig kan kræve yderligere optimering8. Som sådan er projekter, hvor der kun kan laves en begrænset mængde mikrokrystaller, ikke egnede til SFX.
I mellemtiden har synkrotron beamline teknologi i de seneste årtier udviklet sig til at producere mindre, mere stabilebjælker 9 med en glans, der har tilladt dataindsamling fra stadig mindre krystaller10,11. Microfocus beamlines såsom FMX på NSLS-II og I24 på Diamond Light Source har været i stand til at bestemme nye strukturer fra krystaller med maksimale dimensioner på ~ 3 μm12 og demonstrere evnen til at indsamle brugbare data fra endnu mindre krystaller måler ~ 1 μm13. Beamline skal være præcist konfigureret, med fremragende, høj opløsning on-axis-visning optik, en minimal kugle af forvirring for prøve rotation og en præcist justeret rotation akse, der er sammenfaldende med X-ray stråle. Det er vigtigt at nøje matche røntgenstråleprofilen med krystalvolumenet og sikre, at krystallen er præcist justeret i røntgenstrålen – en udfordring for krystaller < 5 μm14. Opfyldelse af disse eksperimentelle forhold på beamline er afgørende for at registrere de bedste kvalitetsdata fra mikrokrystaller.
Det resterende og muligvis vigtigste aspekt af dataindsamling fra mikrokrystaller er præsentationen af krystallen til røntgenstrålen. Mikrokrystaller er ofte blevet monteret på micromesh prøve mounts, fremstillet af polyimid, en lav X-ray spredning materiale med åbninger så små som 10 μm15,16. Polyimid mesh er monteret på en standard pin, der er sat i en magnetisk SPINE base, hvilket gør det kompatibelt med de fleste MX strålelinjer17. Mesh mount bruges til at fiske krystaller fra krystallisering drop ofte efter samme procedure som montering af en 100 μm krystal ved hjælp af en standard loop stil mount. Krystallerne kan fordeles over masken, men en væsentlig ulempe er, at en relativt stor mængde væske kan bæres af masken og stiften under høsten (Figur 1C,D). Denne mængde væske, der kan være mange gange større end krystallerne selv, vil bidrage til baggrundsstøj, når den belyses med røntgenstråler. Denne baggrund scatter kan være endnu stærkere, hvis væsken danner krystallinsk is under flash køling, mindske signal-til-støj forholdet mellem allerede svage intensiteter inden for opløsninger af is diffraktion. Derfor er det vigtigt, at overskydende væske fjernes fra prøven for at sikre, at alle mulige signaler kan registreres. Denne udfordring er endnu større i tilfælde af membranproteinkrystaller dannet inden for lipidkabinefasen (LCP), hvor LCP genererer stærk baggrundsspredning og også er vanskelig at fjerne fra omkring krystallerne 18.
Den nye alsidige MAKROMOEkulære Krystallografi mikrofokus (VMXm) strålelinje på Diamond Light Source giver betingelserne for at indsamle data fra krystaller potentielt måle mindre end et mikron i størrelse. Beamline er designet til at levere en stråleprofil, der måler 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, et goniometer med en forvirringssfære på højst 60 nm og et in vacuo-prøvemiljø. Disse designfunktioner i VMXm-endstationen minimerer strålingsapparatets generering af røntgenstøj i baggrunden under dataindsamlingen med den største resterende baggrundskilde, der genereres af stikprøven14.
Specifikke prøveforberedelsesmetoder, der er designet til VMXm-strålelinjen, giver mulighed for at reducere denne baggrund og yderligere forbedre signal-til-støj af diffraktionsdata, hvilket maksimerer kvaliteten af de data, der kan registreres fra mikrokrystaller, der måler <10 μm. Mange af de krav, der er skitseret her for lav baggrund diffraktion fra mikrokrystaller er også fælles for kryogen transmission elektronmikroskopi (cryoTEM)19 og mikrokrystal elektron diffraktion (microED)20. Som følge heraf er mange af de værktøjer, der allerede er udviklet til fremstilling af kryoTEM-prøver, egnede til fremstilling af mikrokrystaller med nogle tilpasninger. Ved fremstilling af prøver til enkeltpartikel kryoTEM er de undersøgte partikler indlejret i meget tynde lag (typisk < 100 nm) glasis, således at elektroner er i stand til at overføre gennem prøven. Det tynde ensartede lag opnås ved at fjerne overskydende væske, og vitrifikation af prøven opnås ved hurtig afkøling af prøven (~104 K s-1)21 ved at kaste i flydende ethan, der holdes ved ~ 93 K22. I modsætning hertil er flydende nitrogen, som anvendes rutinemæssigt til MX-prøvepræparat, en mindre effektiv kryogen end ethan og har en større tilbøjelighed til krystallinsk isdannelse i prøve21. Dannelsen af krystallinsk is, som kan nedbryde diffraktion og generere baggrundsstøj, afbødes normalt ved brug af kryo-protectant forbindelser23. Lav molekylvægt polymerer såsom poly-ethylenglycol (PEG) 400 og methyl-2,4-pentanediol (MPD), sukker, olier eller mættede salte kan tilsættes til en aliquot af krystallisering løsning i lave koncentrationer24– der er ikke en ‘one size fits all’ løsning til at vælge den mest hensigtsmæssige kryobeskyttende middel, og dette kræver ofte optimering25 . Krystallen gennemgår også flere manipulationer under høsten og kryobeskyttelsesprocessen, hvilket kan resultere i skade på krystallen, muligheden for at udnytte flydende ethan tillader udeladelse af dette trin og hjælper med at beskytte krystallens integritet.
Mens flydende ethan er en effektiv kryogen for mikrokrystaller (<10 μm) på grund af prøvens tyndhed, er der alternative metoder til forebyggelse af krystallinsk idannelse, især i større krystaller, herunder reduktion af krystalens vandindhold ved brug af et stramt kontrolleret fugtigt miljø26, eller gennem fugttransport af overskydende væske væk fra både løkken og overfladen afkrystallen 27 , men disse kræver igen større manipulation af prøven. Brugen af automatiseret blotting og dyk frysning med flydende ethan, som i cryoTEM, tilsammen fjerne overskydende krystallisering løsning og give et middel til at blinke kølige mikrokrystaller på en kontrolleret måde, mens du forsøger at minimere manipulation.
Her præsenterer vi en protokol, der kan udnyttes ikke kun af både brugere af VMXm beamline og på andre mikrofokusstrålelinjer for at indsamle høje signal-til-støj diffraktionsdata, men kan også være nyttige for dem, der forbereder opløselige proteinkrystaller og vaskemiddelbaserede membranproteinkrystalprøver til mikroED-eksperimenter. Mens alle faciliteter til at forberede og vurdere prøver er tilgængelige på VMXm, er mange strukturelle biologilaboratorier i stigende grad udstyret til kryoTEM-prøvepræparat. Som et resultat, vi forestiller os, at nogle brugere kan ønske at bruge deres egne faciliteter til at forberede deres prøver til stråletid på VMXm.
Denne protokol viser, hvordan værktøjer fra kryoTEM prøve forberedelse kan bruges til fremstilling af mikrokrystaller til X-ray diffraktion eksperimenter på mikrofokus strålelinjer. Standard beamline instrumentering er centreret omkring en pin monteret prøve, og mens der er gjort en indsats for at yde en prøve støtte på disse mounts for mikrokrystaller, er de ofte udfordrende at indlæse med prøve og samtidig sikre, at den højeste signal-til-støj opnås (Figur 1C, D). Mange af disse prøver kan også kræve optimering af kryobeskyttelsesbetingelserne for at sikre, at prøven er glasagtig. Frysningsmetoden for dyk giver en repeterbar måde at fjerne overskydende væske på og blinke med at afkøle prøven i et effektivt kryogen (Figur 1A,B). Mens gitteret derefter kan monteres på en standard beamline med en pin pin mount, VMXm prøve indehavere er specielt designet til at acceptere gitre og holde dem under glasset overgang temperatur i et vakuum miljø via ledende køling. Prøven miljø VMXm muliggør lav baggrund dataindsamling, hvor prøven er den resterende kilde til baggrund, og giver en mikrostråle, der kan bruges til at matche krystaller med dimensioner mindre end 10 μm. Denne prøveforberedelsesmetode kan også anvendes til at forberede nanokrystaller til elektron diffraktion, hvor der også er behov for meget lidt overskydende væske og en glasagtig prøve på grund af den svage indtrængen af elektroner. Mens cryoTEM gitre er skrøbelige, dem, der opleves i høst af krystaller i sløjfer vil hurtigt tilpasse sig håndteringen af gitre. Med en lille mængde erfaring vil få gitre gå tabt under blotting, frysning og indlæsning af faser af protokollen. Optimeringstrinnene er dog afgørende for denne succes, og omhyggelig forberedelse vil reducere chancerne for at miste krystaller eller reducere krystalintegriteten.
CryoTEM gitre giver en relativt stor enkelt mount, der kan indeholde mange hundrede krystaller, hvilket forbedrer gennemløb, hvor det kun kan være muligt at registrere en lille kile af diffraktion data. Et enkelt gitter kan også give nok krystaller til at bestemme proteinstrukturen, især i krystaller med høj symmetri. Hvor kun en eller to enkelt krystallisering dråber har genereret mikrokrystaller, forsøg blotting af krystallisering tilstand alene kan bidrage til at sikre, at når mikrokrystaller er blottet, de anvendte tider er så tæt som muligt på dem, der er nødvendige for at generere indledende god kvalitet prøver. Carbon-film understøtter er usynlige for røntgenstråler og fås med forskellige hulafstand, som kan bruges til at passe til en bestemt morfologi. Vi bruger oftest støttefilm med 2 μm huller med en afstand på 2 μm, men mindre huller med større afstand kan være mere passende for krystaller mindre end 2 μm. Andre støttefilm som dem med 1 μm huller med en afstand på 4 μm samt støttefilm med forskellige formede huller er tilgængelige, som alle vil påvirke blottingtiden. Et gitter kvadratisk mesh størrelse på 200 (200 kvadrater per tomme) giver også nok plads (~ 100 μm) mellem kobber gitter barer, således at røntgenstrålen ikke stærkt interagere med kobber og samtidig give nok strukturel støtte til kulstof-film fyldt med krystaller. Brugen af flydende ethan ophæver behovet for kryobeskyttende midler, hvilket igen reducerer kravet om prøvevolumen, der ville have været brugt til optimering af kryobeskyttende forhold.
De vigtigste parametre, der skal optimeres under processen, er blotting gange og prøve fortynding. Blotting gange bør være lang nok til at observere ‘popping’ effekt på tværs af hele nettet, før springet frysning. Over blotting kan resultere i dehydrering af krystallerne, men kontrol af fugtigheden i prøvekammeret bruges til at minimere denne effekt. Mens det foreslås, at en relativ luftfugtighed på 90% anvendes, nogle prøver kan drage fordel i optimering af fugtigheden. Fugtigheden kan påvirke blotting effektiviteten af blotting papir, som langsomt kan blive mættet med vand. Derudover kan fugtighedskontrol i prøvekammeret anvendes til at forbedre diffraktionskvaliteten af krystallerne30. Det anbefales, at der foretages små ændringer (<5 %) i fugtigheden, før diffraktionsintegriteten kontrolleres for at sikre, at diffraktionskvaliteten ikke forringes.
Optimering af ikke-dyrebare prøver kan udføres ved hjælp af et lysmikroskop i stedet for en SEM. Selvom det er destruktivt, er det nyttigt til at vurdere tætheden af krystaller på tværs af nettet og for at muliggøre beslutningstagning om, hvorvidt en prøve skal fortyndes eller koncentreres for bedre at sprede krystaller over gitteret. Dette trin er mest nyttigt, når der er et stort antal krystaller til rådighed og særligt stærkt koncentrerede prøver. Klumpning sammen af krystaller bør undgås (Figur 3), som om det ikke er et væsentligt problem, hvis to krystaller lyser på samme tid under dataindsamling6, vil der sandsynligvis være en større mængde væske omkring klumpen, hvilket reducerer signal-til-støj (figur 5). Mens det er muligt at observere store udskejelser af væske globalt på tværs af nettet ved hjælp af et let mikroskop, kan vurdering af væskemængden omkring mikrokrystallerne og tilstedeværelsen af krystallinsk is kun foretages ved hjælp af et elektronmikroskop udstyret med et kryogent vakuumoverførselssystem og -stadium. Nogle gange, efter påføring af krystallerne til gitteret, og før blotting opstår, kan krystaller i lave viskositetsløsninger bosætte sig langs den ene kant af gitteret. Vi har konstateret, at tilføje op til en 50% endelig koncentration af ethylenglycol kan bremse bevægelsen af krystaller gennem dråben, sikre en bedre fordeling af mikrokrystaller på tværs af nettet samt give større kontrol over blotting ved at øge blotting tid (Figur 3D).
Nogle krystalliseringsløsninger, der indeholder tyktflydende udfældende midler såsom høj molekylvægt PEGs kan vise sig udfordrende at blot, kræver stadig længere blotting gange (>10 s). I sådanne tilfælde kan det være nyttigt at reducere mængden af væske deponeret på bagsiden af nettet samt mængden af krystal indeholdende opløsning til støttefilmsiden af gitteret. Strategier såsom brug af 2 lag blotting papir eller glasfiber kan også støtte blotting i disse vanskelige tilfælde31.
Mens denne rørledning er velegnet til opløselige proteinkrystaller, udgør de, der dannes i meget tyktflydende medier som membranproteiner i LCP, en anden udfordring, som denne protokol ikke er egnet til. Der er imidlertid ved at opstå strategier til forberedelse af LCP-krystaller på kryoTEM-net til mikroED, som omfatter reduktion af prøvernes viskositet ved at fremkalde en faseændring af LCP. Dette gør det muligt at anvende prøverne på gitre på samme måde som dem, der er beskrevet i denne artikel. Endelig kan prøven fræses med en fokuseret ionstråle for at fjerne overskydende ikke-krystalmateriale32,33,34.
Samlet set vil denne rørledning generelt tage 1-2 timer (herunder udstyr setup tid) til at følge fra prøven ankommer til VMXm til at give optimerede gitre med godt spredte, vitrified prøver, afhængigt af prøvens tilgængelighed, koncentrationen af krystaller og viskositet af krystallisering løsning. Disse metoder er allerede med succes blevet anvendt til fremstilling af mikrokrystaller til røntgen diffraktionsforsøg , der undersøger strålingsskader på mikrokrystaller, hvor en minimal mængde væske omkring prøven var afgørende28,35. Det skal bemærkes, at protokollen kan anvendes på alle opløselige mikrokrystalprøver, ikke kun for godt diffrakting prøver, der allerede er optimeret. Et krystalliseringseksperiment, der producerer mikrokrystallinsk materiale, ville traditionelt være et mål for optimering med det formål at opnå større krystaller, men denne prøveforberedelsesmetode og VMXM’s evner kan tillade, at der indsamles tilstrækkelige data fra sådanne prøver uden yderligere optimering. Alternativt, hvis sådanne mikrokrystallinske prøver diffract dårligt, de data, der indsamles fra VMXm ved hjælp af denne prøve forberedelse metode kan stadig fungere som en nyttig vejledning for yderligere optimering af krystallisering betingelser. Værktøjerne til klarning af gitre, herunder glødeudladning og dykfrysning, er nu bredt tilgængelige i forskningsinstitutter, der er udstyret til kryoTEM-eksperimenter, og vil være tilgængelige for mange brugere, der gør det muligt for dem at forberede prøver forud for stråletid på VMXm.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton og Dave Stuart, STRUBI University of Oxford og Rachel Bolton, University of Southampton for venligt at give microcrystal prøver til udvikling og demonstration af prøveforberedelse metoder til VMXm beamline ud over at muliggøre idriftsættelse af beamline. Forfatterne vil også gerne takke iNEXT-Discovery (projektnummer 871037) for muligheden og støtten til at offentliggøre dette manuskript.
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |