هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في مورفوجينيا العصب في شبكية العين بعد الولادة بواسطة المجهر البؤري بفاصل زمني. نحن نصف نهجا لوضع العلامات المتناثرة واكتساب أنواع خلايا الشبكية وعملياتها الدقيقة باستخدام ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre.
يتطلب اكتشاف الآليات التي تنميط العرش التغصني طرقا لتصور التشعبات وتصويرها وتحليلها أثناء التطوير. شبكية العين الفأر هو نظام نموذجي قوي للتحقيق في الآليات الخاصة بنوع الخلية لتكوين الخلايا العصبية والاتصال. تنظيم وتكوين الأنواع الفرعية للشبكية محددة جيدا، والأدوات الجينية متاحة للوصول إلى أنواع محددة أثناء النمو. كما أن العديد من أنواع خلايا الشبكية تقيد التشعبات و / أو المحاور العصبية الخاصة بها إلى طبقات ضيقة ، مما يسهل التصوير بفاصل زمني. تعتبر مزارع استئصال شبكية العين للفئران مناسبة تماما لتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات ، ولكن الطرق المحسنة لتصوير ديناميكيات التشعبات ذات الدقة الزمنية والهيكلية غير موجودة. تظهر هنا طريقة لتسمية وتصوير تطور مجموعات شبكية محددة تتميز بنظام Cre-Lox بشكل ضئيل. الفيروسات المرتبطة بالغدية المتاحة تجاريا (AAVs) المستخدمة هنا عبرت عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre. ينتج عن الولادة داخل العين ل AAVs في الفئران حديثي الولادة وضع علامات الفلورسنت على أنواع الخلايا المستهدفة قبل 4-5 أيام بعد الحقن (dpi). يمكن اكتشاف إشارات الفلورسنت الغشائية عن طريق التصوير البؤري وحل هياكل الفروع الدقيقة والديناميكيات. يتم الحصول على مقاطع فيديو عالية الجودة تمتد من 2 إلى 4 ساعات من تصوير الحوامل المسطحة للشبكية التي يتم دمجها مع السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المؤكسج (aCSF). كما يتم توفير خط أنابيب ما بعد معالجة الصور لإزالة الالتفاف وتصحيح الانجراف ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن استخدام هذا البروتوكول لالتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة وتحديد العوامل الجديدة التي تتحكم في تكوين الخلايا العصبية. ستكون العديد من الاستراتيجيات التنموية التي تم تعلمها في شبكية العين ذات صلة بفهم تكوين الدوائر العصبية في أماكن أخرى من الجهاز العصبي المركزي.
تشكل تشعبات الخلايا العصبية الشبكية أنماطا معقدة، ولكنها محددة، تؤثر على وظيفتها داخل الدوائر العصبية. في شبكية العين الفقارية، تحمل أنواع متنوعة من الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) والخلايا العصبية الداخلية لخلايا أماكرين مورفولوجيا تغصنية فريدة تختلف في حجم الشجرة وموقعها وطول فرعها وكثافتها1. أثناء تطور ما بعد الولادة، تقوم RGCs وخلايا أماكرين بتوسيع العمليات الشجيرية الوفيرة إلى عصبية تسمى الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL)، حيث تتلقى مدخلات الخلايا ثنائية القطب التي تنقل إشارات المستقبلات الضوئية2. وكما تم التقاطه من خلال التصوير بفاصل زمني لمجموعات شبكية العين الموصوفة بالفلورسنت في يرقات الكتاكيت أو الزرد، فإن التشكل التشعبي ديناميكي للغاية3،4،5. في غضون أيام ، تتوسع العرش الشجيرية ، وتعيد تشكيلها ، وتتشعب إلى طبقات فرعية ضيقة من IPL ، حيث تتشابك مع شركاء مختارين. تظهر العرش ديناميكيات هيكلية مختلفة على التنمية ، مع تغيرات في المعدلات النسبية لإضافة الفرع والتراجع والاستقرار. تظهر التشعبات Amacrine و RGC أيضا سلوكيات مختلفة للنمو وإعادة التشكيل قد تعكس التشجير الخاص بالنوع. ومع ذلك ، تتبعت هذه الدراسات مجموعات واسعة من الأماكرين أو RGC وركزت على الاستهداف الرقائقي ، وهو مجرد جانب واحد من جوانب المورفولوجيا.
الآليات التي تنتج التنوع المورفولوجي الهائل الذي لوحظ عبر الأنواع الفرعية للشبكية غير مفهومة بشكل جيد. كان الهدف من هذه المجموعة هو تطوير طريقة لالتقاط ديناميكيات التشعبات وإعادة تشكيل الشجرة لأنواع فرعية محددة من الشبكية في الفئران. يتطلب تحديد الآليات الخاصة بنوع الخلية لنمط التشعبات طرقا لتصور وقياس سلوكيات التشعبات للخلايا ذات الاهتمام. تعتبر الثقافات العضوية لشبكية العين الفئران مناسبة تماما لدراسات تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات. يتم تشريح الشبكية النامية وتركيبها في إكسبوات مسطحة يمكن تصويرها لعدة ساعات في غرفة التسجيل أو استزراعها على مدى بضعة أيام مع تأثيرات محدودة على الدوائر6,7. يمكن تصنيف الخلايا العصبية الحية في شبكية العين من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك ملء الصبغة بواسطة الأقطاب الكهربائية، والمعالجة الكهربائية، والتسليم الحيوي للجسيمات المغلفة بالأصباغ المحبة للدهون أو البلازميدات التي تشفر البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، Gene Gun)، بالإضافة إلى ملصقات الخلايا المشفرة وراثيا7،8،9،10 . ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير فعالة لتصوير ديناميكيات التشعبات لأنواع فرعية محددة من الشبكية. على سبيل المثال ، طرق ملء الأصباغ منخفضة الإنتاجية وتتطلب جهاز الفيزيولوجيا الكهربية وملصقات جينية إضافية لاستهداف الخلايا ذات الأهمية بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يمكن لإشارات التألق القوية في السوما أن تحجب التشعبات القريبة.
يمكن لطرق توصيل الجينات الحيوية تسمية عشرات الخلايا في وقت واحد ، ولكن الخطوات التي تنطوي على توصيل الجسيمات عالية الضغط وحضانة الشبكية المعزولة بين عشية وضحاها يمكن أن تضر بفسيولوجيا الخلايا والنمو الشجيري. تقترح هذه الورقة أنه يمكن استخدام الأدوات الجينية الحديثة لالتقاط ديناميكيات التشعبات المبكرة مع نوع الخلية والدقة الهيكلية ، بالنظر إلى المعايير التجريبية التالية. أولا ، لحل الفروع الدقيقة والفيلوبوديا التي تهيمن على العرش النامي ، يجب أن تقوم الطريقة بتسمية الخلايا العصبية بالبروتينات الفلورية الساطعة التي تملأ العمليات في الشجرة بأكملها. يجب ألا تتلاشى العلامات الفلورية بسبب التبييض الضوئي خلال فترة التصوير. تم إنشاء مجموعة متنوعة من متغيرات البروتين الفلوري ومقارنتها من أجل ملاءمتها للتصوير في الجسم الحي / خارج الجسم الحي11 بناء على السطوع والاستقرار الضوئي. ثانيا ، يجب التعبير عن البروتينات الفلورية (XFPs) بمستويات عالية بما فيه الكفاية بحلول المرحلة المبكرة من تكوين أشكال التشعبات ، بحيث لا يتم تفويت نافذة النمو الضيقة. في تحليلات النقاط الزمنية الثابتة في شبكية العين الفأرية، يحدث تطور التشعبات خلال الأسبوع الأول بعد الولادة ويشمل مراحل النمو وإعادة التشكيل والاستقرار10،12،13،14،15. ثالثا ، يجب أن تؤدي الطريقة إلى وضع علامات انتقائية أو إلى زيادة احتمال وضع العلامات على السكان الفرعيين للخلايا العصبية ذات الاهتمام. رابعا ، يجب أن يكون وضع العلامات على السكان الفرعيين المستهدفين متناثرا بما فيه الكفاية بحيث يمكن تحديد الشجرة العصبية بأكملها وتتبعها. على الرغم من أنه يمكن تمييز الأنواع الفرعية RGC و amacrine من خلال خصائصها المورفولوجية الناضجة وأنماط التقسيم الطبقي IPL16،17،18،19،20 ، فإن التحدي هو تحديد الأنواع الفرعية أثناء التطوير بناء على هياكل غير ناضجة. يتم تسهيل هذه المهمة من خلال توسيع الأدوات المعدلة وراثيا لتسمية أنواع محددة من خلايا الشبكية أثناء التطوير.
تستخدم خطوط الفئران المعدلة وراثيا والطرق السريعة التي يتم فيها تحديد التعبير الخلوي والزمني للبروتينات الفلورية أو Cre بواسطة العناصر التنظيمية الجينية على نطاق واسع لدراسة أنواع خلايا الشبكية13،21،22،23. وقد جاءت الملاحظات الرئيسية حول أنماط محددة من النوع الفرعي لتطور التشعبات من دراسات شبكية العين الفئران المعدلة وراثيا في نقاط زمنية ثابتة10،14،24،25. يتيح نظام Cre-Lox ، على وجه الخصوص ، معالجة الجينات الرائعة ومراقبة الأنواع الفرعية باستخدام مجموعة متنوعة من المراسلين المعتمدين على المؤتلف وأجهزة الاستشعار والمنشطات البصرية الوراثية. وقد أدت هذه الأدوات إلى اكتشاف برامج جزيئية خاصة بنوع فرعي وخصائص وظيفية تكمن وراء تجميع دائرة الشبكية26،27،28،29،30. ومع ذلك ، لم يتم الاستفادة منها بعد لدراسة ديناميكيات التشعبات الخاصة بالنوع الفرعي في شبكية العين الفأرية. يمكن تحقيق وضع العلامات منخفضة الكثافة من خلال الجمع بين خطوط الماوس Cre والجينات المحورة التي يتم إدخالها بواسطة الكهربية أو بواسطة AAVs المؤتلفة. إذا كان ذلك متاحا، يمكن أيضا استخدام خطوط كري المستحثة بالتاموكسيفين أو الاستراتيجيات الجينية المتقاطعة. وأخيرا، ينبغي وضع علامة على الخلية بطريقة طفيفة التوغل وتصويرها باستخدام معلمات الاكتساب حتى لا تتعرض الأنسجة للخطر أو تتداخل مع الوظيفة الخلوية اللازمة لتكوين التشعبات.
تظهر هنا طريقة لتطبيق الأدوات المعدلة وراثيا والمجهر البؤري للتحقيق في ديناميكيات التشعبات في عمليات استئصال شبكية العين الحية للفئران. تم دمج خطوط الفئران المعدلة وراثيا Cre مع ناقلات AAV التي تعبر عن البروتينات الفلورية عند إعادة تركيب Cre ، مما يسمح بوضع علامات متفرقة على خلايا الشبكية ذات الاهتمام. يتم تسليم AAVs المتاحة تجاريا إلى شبكية العين حديثي الولادة عن طريق الحقن داخل الجسم الزجاجي. توضح هذه الورقة أن AAVs تنتج تعبيرا فلوريا عاليا وخاصا بنوع الخلية بنسبة 4 نقاط في البوصة ، مما يسمح بالوصول إلى نقاط زمنية بعد الولادة. ولتوضيح هذا النهج، تم تصنيف الإنترنورون الأماكرين “الانفجار النجمي” الكوليني عن طريق توصيل Brainbow AAV في الفئران حديثي الولادة التي تعبر عن أستيل ترانسفيراز الكولين (ChAT) – موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES)-Cre transgene ، والذي ينشط في شبكية العين المبكرة بعد الولادة31,32. تطور خلايا الأماكرين النجمية مورفولوجيا شجرية نمطية وشعاعية تتشكل من خلال تجنب التعفن الذاتي بوساطة البروتوكادهيرينات المتجمعة33,34. تظهر هذه الورقة أن دقة التشعبات النجمية والفيلوبوديا قد تحسنت بشكل كبير بواسطة XFPs إلى غشاء البلازما مع إضافة زخارف CAAX التي تخضع للفارنيزيل ، كما هو مستخدم في Brainbow AAVs31. وأخيرا، تم تحديد بروتوكولات التصوير بالفاصل الزمني وما بعد المعالجة التي تنتج صورا عالية الجودة قابلة لإعادة بناء التشعبات والقياس الكمي المورفومتري. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العوامل التي تتحكم في تشكل التشعبات والتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة.
يوضح هذا الفيديو خط أنابيب تجريبي يستخدم الأدوات الجينية الحالية لتصوير ديناميكيات التشعبات لتطوير الخلايا العصبية الشبكية مع التصوير الحي البؤري. كما أظهرت الحقن داخل العين من AAVs المعتمدة على Cre التي تشفر البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء في الفئران حديثي الولادة. يتم تصنيف الخلاي…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ماديسون غراي على إعطائي يد العون عندما لم يكن لدي أي يد. تم دعم هذا البحث من قبل منحة NSERC Discovery (RGPIN-2016-06128) ، وزمالة سلون في علم الأعصاب وكرسي أبحاث كندي من المستوى 2 (إلى J.L.L). تم دعم S. Ing-Esteves من قبل برنامج أبحاث علوم الرؤية ومنح NSERC للدراسات العليا – الدكتوراه.
Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
Dissection tools | |||
Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Live-imaging incubation system | |||
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Neonatal Injections | |||
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
Software | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |