Tidsforløpavbildning av nevronal arborisering ved hjelp av sparsom adeno-assosiert virusmerking av genetisk målrettede retinalcellepopulasjoner

Summary

Her presenterer vi en metode for å undersøke nevritt morfogenese i postnatal mus retinal explants ved tidsforløp konfokal mikroskopi. Vi beskriver en tilnærming for sparsommerking og oppkjøp av retinal celletyper og deres fine prosesser ved hjelp av rekombinante adeno-assosierte virusvektorer som uttrykker membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte.

Abstract

Å oppdage mekanismer som mønster dendritiske arbors krever metoder for å visualisere, bilde og analysere dendritter under utvikling. Mus netthinnen er et kraftig modellsystem for undersøkelse av celletypespesifikke mekanismer for nevronal morfogenese og tilkobling. Organiseringen og sammensetningen av retinal subtyper er veldefinerte, og genetiske verktøy er tilgjengelige for å få tilgang til bestemte typer under utvikling. Mange retinal celletyper begrenser også dendrittene og/eller axonene til smale lag, noe som letter tidsforløpavbildningen. Mus netthinnen explant kulturer er godt egnet for live-celle avbildning ved hjelp av confocal eller multiphoton mikroskopi, men metoder optimalisert for avbildning dendrite dynamikken med temporal og strukturell oppløsning mangler. Presentert her er en metode for å sparsomt merke og bilde utviklingen av spesifikke netthinnepopulasjoner preget av Cre-Lox-systemet. Kommersielt tilgjengelige adeno-assosierte virus (AAVs) som brukes her uttrykte membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte. Intraokulær levering av AAVer hos nyfødte mus produserer fluorescerende merking av målrettede celletyper med 4-5 dager etter injeksjon (dpi). Membranfluorescerende signaler kan påvises ved konfektavbildning og løse fine grenstrukturer og dynamikk. Videoer av høy kvalitet som spenner over 2-4 timer er anskaffet fra imaging retinal flat-mounts perfused med oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Også gitt er et bilde etterbehandling rørledning for dekonvolusjon og tredimensjonal (3D) drift korreksjon. Denne protokollen kan brukes til å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen og for å identifisere nye faktorer som kontrollerer nevritt morfogenese. Mange utviklingsstrategier lært i netthinnen vil være relevante for å forstå dannelsen av nevrale kretser andre steder i sentralnervesystemet.

Introduction

Dendritter av retinal nevroner danner intrikate, men spesifikke, mønstre som påvirker deres funksjon i nevrale kretser. I virveldyr netthinnen, ulike typer retinal ganglion celler (RGCs) og amacrine celle interneurons bære unike dendritiske morfologier som varierer i arbor størrelse, plassering, gren lengde, og ^tetthet1. Under postnatal utvikling utvider RGCer og amacrine celler sprudlende dendrittiske prosesser til en neuropil kalt det indre plexiformlaget (IPL), hvor de mottar bipolare celleinnganger som overfører fotoreseptorsignaler2. Som fanget av tidsforløpavbildning av fluorescerende merkede retinalpopulasjoner hos kylling- eller sebrafisklarver, er dendritmorfogenese svært dynamisk3,4,5. I løpet av få dager utvides, ombygges og ramifiseres dendritiske arbors for å begrense underlagene til IPL, der de synapserer med utvalgte partnere. Arbors viser forskjellig strukturell dynamikk over utvikling, med endringer i relative rater av gren tillegg, tilbaketrekning og stabilisering. Amacrine og RGC dendritter viser også forskjellige utvekst- og ombyggingsvirkemåter som kan gjenspeile typespesifikk arborisering. Imidlertid sporet disse studiene brede amacrine- eller RGC-populasjoner og fokuserte på laminær målretting, som bare er ett aspekt av morfologi.

Mekanismene som produserer det enorme morfologiske mangfoldet som observeres på tvers av netthinneundertyper, er dårlig forstått. Målet med denne gruppen var å utvikle en metode for å fange dendritdynamikk og arbor ombygging av definerte retinal subtyper hos mus. Identifisering av celletypespesifikke mekanismer for dendritmønster krever metoder for å visualisere og måle dendritoppførsel av celler av interesse. Organotypiske kulturer av mus netthinner er godt egnet for levende celle bildestudier ved hjelp av konfikal eller multifoton mikroskopi. Utvikling av netthinner dissekeres og monteres i en flat utvisning som kan avbildes i flere timer i et opptakskammer eller dyrkes over noen dager med begrensede effekter på ^{kretsløpet6,7}. Levende retinal nevroner kan merkes med en rekke teknikker, inkludert fargestofffylling av elektroder, elektroporasjon, biolistisk levering av partikler belagt med lipofile fargestoffer eller plasmider som koder fluorescerende proteiner (f.eks. Gene Gun), samt genetisk kodede celleetiketter7,8,9,10 . Disse tilnærmingene er imidlertid ineffektive for avbildning av dendritdynamikk av spesifikke netthinneundertyper. For eksempel er fargestofffyllingsmetoder lav gjennomstrømning og krever elektrofysiologiapparater og ekstra genetiske etiketter for pålitelig å målrette celler av interesse. Videre kan de sterke fluorescenssignalene i soma skjule nærliggende dendritter.

Biolistiske genleveringsmetoder kan samtidig merke dusinvis av celler, men trinn som involverer høytrykkspartikkellevering og nattinkubasjon av isolert netthinne kan kompromittere cellefysiologi og dendritisk utvekst. Denne artikkelen foreslår at nyere genetiske verktøy kan brukes til å fange tidlig dendritdynamikk med celletype og strukturell oppløsning, gitt følgende eksperimentelle kriterier. For det første, for å løse de fine grenene og filopodia som dominerer utviklingen av arbors, bør metoden merke nevroner med lyse, fluorescerende proteiner som fyller prosesser i hele arboret. Fluorescensmerkingen skal ikke falme på grunn av fotobleking i bildeperioden. En rekke fluorescerende proteinvarianter er generert og sammenlignet for egnethet for in vivo/ex vivo ^imaging11 basert på lysstyrke og fotostabilitet. For det andre må fluorescerende proteiner (XFPer) uttrykkes på tilstrekkelig høye nivåer ved det tidligste stadiet av dendritmorfogenese, slik at det smale utviklingsvinduet ikke går glipp av. I analyser av statiske tidspunkter i musetina forekommer dendritutvikling i løpet av den første barseluken og inkluderer faser av utvekst, ombygging og stabilisering10,12,13,14,15. For det tredje bør metoden føre til selektiv merking eller økt sannsynlighet for merking av den nevronale subpopulasjonen av interesse. For det fjerde må merkingen av måldelpopulasjonen være tilstrekkelig sparsom slik at hele nevronal arbor kan identifiseres og spores. Selv om RGC og amacrine undertyper kan preges av deres modne morfologiske egenskaper og IPL stratifiseringsmønstre16,17,18,19,20, er utfordringen å identifisere undertyper under utvikling basert på umodne strukturer. Denne oppgaven forenkles ved utvidelse av transgene verktøy for å merke spesifikke netthinnecelletyper under utvikling.

Transgene og knock-in muselinjer der cellulære og temporale uttrykk for fluorescerende proteiner eller Cre bestemmes av genregulatoriske elementer er mye brukt til å studere retinal celletyper13,21,22,23. Sentrale observasjoner om subtypespesifikke mønstre for dendritutvikling har kommet fra studier av transgene mus netthinner på statiske tidspunkter10,14,24,25. Spesielt Cre-Lox-systemet muliggjør utsøkt genmanipulering og overvåking av undertyper ved hjelp av en rekke rekombinaseavhengige reportere, sensorer og optogenetiske aktivatorer. Disse verktøyene har ført til funn av subtypespesifikke molekylære programmer og funksjonelle egenskaper som ligger til grunn for retinal kretsmontering26,27,28,29,30. Imidlertid har de ennå ikke blitt utnyttet til å studere subtype-spesifikk dendritdynamikk i mus netthinnen. Merking med lav tetthet kan oppnås ved å kombinere Cre-muselinjer med transgenes introdusert av elektroporasjon eller ved rekombinante AAVer. Hvis tilgjengelig, tamoxifen-inducible Cre linjer eller interseksjonelle genetiske strategier kan også brukes. Til slutt bør cellen merkes på en minimalt invasiv måte og avbildet ved hjelp av oppkjøpsparametere for ikke å kompromittere vevet eller forstyrre cellulær funksjon som kreves for dendritmorfogenese.

Presentert her er en metode for å bruke transgene verktøy og konfokal mikroskopi for å undersøke dendritdynamikk i levende mus retinal explants. Cre transgene muselinjer har blitt kombinert med AAV-vektorer som uttrykker fluorescerende proteiner ved Cre-rekombinasjon, noe som gir mulighet for sparsom merking av retinalceller av interesse. Kommersielt tilgjengelige AAVer leveres til neonatal netthinne ved intravitreale injeksjoner. Dette dokumentet viser at AAVer produserer betydelig høyt og celletypespesifikk fluorescerende uttrykk med 4 dpi, noe som gir tilgang til postnatale tidspunkter. For å illustrere denne tilnærmingen ble den kolinerge “starburst” amacrine internuron merket ved å levere Brainbow AAV i neonatale mus som uttrykker kolin acetyltransferase (ChAT)-intern ribosome entry site (IRES)-Cre transgene, som er aktiv i den tidlige postnatale ^{netthinnen31,32}. Starburst amacrine celler utvikle en stereotyp og radial arbor morfologi som er formet av dendrite selvunngåelse formidlet av klynget protocadherins33,34. Dette papiret viser at oppløsningen av stjerneskudd dendritter og filopodia er betydelig forbedret av XFPs til plasmamembranen med tilsetning av CAAX-motivet som gjennomgår farnesylering, som brukes til Brainbow ^AAVs31. Til slutt er det fastslått tidsforløpavbildnings- og etterbehandlingsprotokoller som produserer bilder av høy kvalitet som kan brukes til dendritrekonstruksjon og morfometrisk kvantifisering. Denne protokollen kan brukes til å identifisere faktorer som kontrollerer dendritmorfogenese og for å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen.

Protocol

MERK: Denne protokollen strekker seg over 2 dager med en minimumsperiode på 4-5 dager for viral transduksjon mellom eksperimentelle dager (figur 1A). Dyreforsøk utføres i samsvar med Canadian Council on Animal Care Guidelines for Use of Animals in Research and Laboratory Animal Care under protokoller godkjent av Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee ved Hospital for Sick Children (Toronto, Canada). 1. Forberedelser til neonatale AAV-injeksjo…

Representative Results

Ved hjelp av protokollen ovenfor ble en høyoppløselig 3D-video av å utvikle stjerneskuddcelle dendritter anskaffet, dekonvolvert og korrigert for 3D-drift. Z-plane maksimale projeksjoner ble produsert for å lage 2D-videoer for analyse (Supplementary Video 1, Figur 5A). 3D-dekonvolusjon av hvert tidspunkt økte oppløsningen av fine filopodiaprojeksjoner (figur 5B, C). Fine filopodia fremspring er en funksjon av å utvikle re…

Discussion

Denne videoen demonstrerer en eksperimentell rørledning som bruker eksisterende genetiske verktøy for å bilde dendrite dynamikken i å utvikle retinal neuroner med konfiskert live-imaging. Også demonstrert er intraokulære injeksjoner av Cre-avhengige AAVs koding membran-målrettede fluorescerende proteiner i neonatal mus. Enkeltceller av genetisk målrettede populasjoner er sterkt merket så tidlig som 4-5 dpi. Retinal flat-mounts ble forberedt for standard bildekamre for å utføre live-celle konfølende avbildning…

Materials

Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Dissection tools
Cellulose filter paper	Whatman	1001-070
Dumont #5 fine forceps	FST	11252-20	Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection
Dumont forceps	VWR	82027-426
Fine Scissors	FST	14058-09
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size	Millipore	HABG01 300
Petri Dish, 50 × 15 mm	VWR	470313-352
Polyethylene disposable transfer pipette	VWR	470225-034
Round tip paint brush, size 3/0	Conventional art supply store		Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting
Surgical Scissors	FST	14007-14
Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge	FST	15000-08
Live-imaging incubation system
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10'	Warner Instruments	64-0755
Dual channel heater controller, Model TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective	Leica	15506374
Heater controller cable	Warner Instruments	CC-28
Large bath incubation chamber with slice support	Warner Instruments	RC-27L
MPII Mini-Peristaltic Pump	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater)	Warner Instruments	PM-6D
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump	Harvard Apparatus	55-4148
Sample anchor (Harps)	Warner Instruments	64-0260	Sample anchor must be compatible with incubation chamber
Sloflo In-line Solution Heater	Warner Instruments	SF-28
Neonatal Injections
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle	Hamilton Company	80314
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch)	BD PrecisionGlide	305106
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	Penn Vector Core	AV-9-PV2453	Addgene Plasmid #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Green tattoo paste	Ketchum MFG Co	329A
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	806552
Pneumatic PicoPump	WPI World Precision Instruments	PV-820
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)	AirGas	X02OX95C2003102	Supplier may vary depending on region
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, Free Acid	Bio Basic	HB0264
Hydrochloric acid solution, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670
pH-Test strips (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Sodium chloride (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Open source