Firedoble sjakkbrett: En modifikasjon av det tredimensjonale sjakkbrettet for å studere stoffkombinasjoner

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man studerer alle mulige kombinasjoner som kan oppnås mellom fire legemidler i ett enkelt eksperiment. Denne metoden er basert på standard 96-brønns mikrofortynningsanalyse og beregning av fraksjonelle hemmende konsentrasjoner (FICer) for å evaluere resultatene.

Abstract

Konseptet med legemiddelkombinasjonsterapi blir svært viktig, hovedsakelig med den drastiske økningen i resistens mot narkotika. Quadruple checkerboard, også kalt Q-checkerboard, tar sikte på å maksimere antall mulige kombinasjoner som kan oppnås mellom fire stoffer i ett eksperiment for å minimere tiden og arbeidet som trengs for å oppnå de samme resultatene med andre protokoller. Denne protokollen er basert på den enkle mikrofortynningsteknikken der stoffene fortynnes og kombineres sammen i flere 96-brønnsplater.

I det første settet med 96-brønnsplater tilsettes Muller-Hinton-kjøttkraft etterfulgt av det første nødvendige stoffet (f.eks. Cefotaxime her) for å fortynne det serielt. Etter at det første trinnet er gjort, brukes et annet sett med 96-brønnsplater til å fortynne det andre stoffet (f.eks. Amikaci), som vil bli overført ved å fjerne et bestemt volum av legemiddel 2 og sette inn de tilsvarende brønnene i det første settet med 96-brønnsplater som inneholder stoff en. Det tredje trinnet gjøres ved å legge til de nødvendige konsentrasjonene av det tredje stoffet (f.eks. Levofloxacin), til de riktige platene i det første settet som inneholder kombinasjon av legemiddel 1 og 2. Det fjerde trinnet gjøres ved å legge til de nødvendige konsentrasjonene av det fjerde stoffet (f.eks. Trimethoprim-sulfametoksazol) i de riktige platene i det første settet. Deretter vil E. coli ESBL bakteriell inoculum bli forberedt og tilsatt.

Denne metoden er viktig for å evaluere alle mulige kombinasjoner og har et bredere spekter av muligheter som skal testes videre for in vivo-testing. Til tross for at det er en slitsom teknikk som krever mye fokus, er resultatene bemerkelsesverdige og tidsbesparende der mange kombinasjoner kan testes i et enkelt eksperiment.

Introduction

Med økningen i motstand på grunn av overforbruk og misbruk av antibiotika^1,2, har behovet for å utvikle nye stoffer og midler for å behandle bakterielle infeksjoner blitt avgjørende. Nye tilnærminger som utvikling av nye legemidler er svært viktig for å overvinne motstandskrisen. Den farmasøytiske industrien er imidlertid ikke interessert i å utvikle nye antimikrobielle midler. Videre, hvis nye stoffer utvikles, vil bakterier fortsette å utvikle seg og utvikle motstand mot disse nye stoffene^3,4. Dermed vil problemet med motstand ikke bli løst, noe som gjør behovet for en annen tilnærming til et must som bør vurderes og studeres for å overvinne bakteriell motstand.

Legemiddelkombinasjon er et svært viktig konsept for behandling av bakterielle infeksjoner hovedsakelig de som er forårsaket av multidrug-resistente patogener^5,6. Det reduserer behandlingsforløpet, reduserer dosen som er gitt; Dermed reduserer toksisiteten til det gitte stoffet, bidrar til å redusere graden av motstandsutvikling og på en måte sensibiliserer bakteriene til de gitte stoffene som beskrevet i begrepet sikkerhetsfølsomhet^5,7,8,9.

Motstandsutvikling til ett stoff krever en enkelt mutasjon; Resistensutviklingen mot en kombinasjon av legemidler rettet mot flere veier krever imidlertid flere uavhengige mutasjoner som bremses av denne kombinasjonen. Et eksempel på redusert motstand mens du bruker kombinasjonsterapi er den reduserte motstandshastigheten mot Rifampin i Mycobacterium Tuberculosis¹⁰. Et annet eksempel er en studie gjort av Gribble et al. som viste frekvensen av fremveksten av resistente stammer hos pasienter som tar Piperacillin alene for å være høyere enn hos de som tar en kombinasjon av karboksypenicillin og aminoglykosid¹⁰. Studier har vist at resistensutvikling mot aminoglykosider i utviklende bakterier gjorde disse stammene følsomme for ulike andre legemidler⁵. Kombinasjonen mellom beta-laktam klasse stoffet amoksicillin og laktamasehemmeren clavulanic acid viste suksess i behandling av resistente bakteriestammer⁸.

Å redusere behandlingstidspunktet er en god fordel som følge av legemiddelkombinasjoner. For eksempel vil en terapi av kombinert penicillin eller ceftriaxon med gentamicin i 2 uker gi samme effekt gitt av penicillin eller ceftriaxon alene når det gis i 4 uker¹¹. Kombinere medisiner gjør det mulig å bruke lavere doser av legemidler som ikke er effektive når de gis alene, for eksempel Sub-MICene. Eksempelet på sulfonamider kan gis der bruk av trippel-sulfonamider minimerer, ved lavere doser, toksisiteten som produseres som er krystalldannelse eller krystalliuri ved bruk av uoppløselige sulfonamider ved fulle doser¹².

Dermed vil reduksjon av doseringen gitt og behandlingstidspunktet til slutt redusere toksisiteten til legemidlene på kroppen. Ideen om å utvikle metoder for å vurdere samspillet mellom kombinerte legemidler er svært viktig. I en studie viste resultatene at kombinasjonsterapi er mer effektiv for behandling av resistente arter av Acinetobacter og P. aeruginosa⁸.

Gi narkotika i kombinasjon
Det finnes forskjellige metoder som vi kan studere stoffkombinasjoner, for eksempel checkerboard-metoden, time-kill kurvemetoden og E-testmetoden¹³. Checkerboard-metoden kan studere alle mulige kombinasjoner mellom de to aktuelle stoffene i selve eksperimentet. I tillegg ble det utviklet for å studere en kombinasjon av tre stoffer¹⁴. Nå utvider vi dette for å studere en kombinasjon av fire stoffer hovedsakelig for behandling av multidrug-resistente patogener.

Tidsdrepende kurveanalysen utføres vanligvis for å teste for bakteriedrepende effekten av et bestemt stoff. Det ble også brukt til å teste effekten av legemiddelkombinasjoner der flere stoffer kombineres ved spesifikke konsentrasjoner. Denne protokollen krever tilberedning av flere sterile rør eller kopper der vi i hver kopp legger til buljongen, kombinasjonen av narkotika og den nødvendige bakteriestammen. Etter inkubasjon og registrering av den optiske tettheten på flere tidspunkter, sammenlignes resultatene med den normale vekstraten for den brukte stammen for å se om vekstraten økte, reduserte eller ikke endret^{seg 13}.

E-testmetode gjøres vanligvis for å teste for den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) der en stripe som inneholder en gradientkonsentrasjon av det aktuelle stoffet, settes på en inokulert plate. Det ble også brukt til å teste kombinasjonen mellom to stoffer der to strimler legges til platen på en vinkelrett måte som krysser ved DERES MIC¹³.

Ifølge litteraturen er det ingen gullstandard for å definere og studere synergi; Dermed er det vanskelig å vurdere hvilken av metodene som brukes til å studere kombinasjon er bedre og hvilken som gir bedre og mer pålitelige resultater hovedsakelig¹³. Imidlertid er Time-kill analyse arbeidsintensiv, tidkrevende og dyr^15,16, mens E-testmetoden er utviklet for å studere en kombinasjon mellom bare to stoffer. Checkerboard kan studere alle mulige kombinasjoner mellom de to legemidlene som er testet, og dette er grunnen til at denne teknikken er valgt til å utvikles.

Protocol

1. Forberedelsestrinn Forbered Muller-Hinton kjøttkraft (MHB) ved å tilsette 25 g MH kjøttkraft til 1 L destillert vann og bland. Autoklav ved 121 °C i 2,5 timer. Deretter lagrer du det autoklavede mediet ved romtemperatur eller i kjøleskapet. Subkultur de aktuelle bakteriene (E. coli ESBL) på agarmediene ved hjelp av den fire-kvadrant stripemetoden og inkubere over natten ved 37 °C. Bruk en steril sløyfe, ta en koloni og spre den i første halvdel av MacConkey agarplaten ved …

Representative Results

Figur 2A representerer resultatene oppnådd ved å kombinere Cefotaxime og Amikacin med spesifikke konsentrasjoner av Levofloxacin og Trimethoprim-sulfametoksazol. Vi kan se i venstre del av figuren de fire platene som skjematisk presenteres med konsentrasjonene av stoffene i høyre del av figuren. Pilene representerer brønnene på vekst/ingen vekst-grensesnittet. De fargede brønnene er brønnene som inneholder vekst. Vi merker at den fjerde platen ikke inneholder vekst i kvadranten som in…

Discussion

Quadruple Checkerboard-metoden ligner sjakkbrettet og det tredimensjonale sjakkbrettet i protokollen. Imidlertid bør det tas hensyn til visse viktige skritt for å unngå feil under eksperimentet.

Sørg for å teste for MIC for hvert legemiddel mot den testede isolasjonen før du starter protokollen for å vite hva som er konsentrasjonene som trengs for å starte fortynning med for legemiddel 1 og legemiddel 2 som må fortynnes serielt i platene. Når det gjelder legemiddel 3 og legemiddel 4,…

Materials

1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3