حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة
Summary
هنا ، نصف الإجراءات التي تم تطويرها في مختبرنا لإعداد مساحيق بلورات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED).
Abstract
تم وصف بروتوكول مفصل لإعداد عينات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED). تم تطوير MicroED لحل هياكل البروتينات والجزيئات الصغيرة باستخدام معدات الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) القياسية. بهذه الطريقة ، تم مؤخرا تحديد الجزيئات الصغيرة والببتيدات والبروتينات القابلة للذوبان والبروتينات الغشائية بدقة عالية. يتم تقديم البروتوكولات هنا لإعداد شبكات من المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام عقار كاربامازيبين كمثال. يتم تقديم بروتوكولات لفحص وجمع البيانات. يتم تقديم خطوات إضافية في العملية الشاملة ، مثل تكامل البيانات وتحديد الهيكل والتحسين في مكان آخر. يقدر الوقت اللازم لإعداد شبكات الجزيئات الصغيرة بأقل من 30 دقيقة.
Introduction
حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED) هو طريقة مجهرية إلكترونية بالتبريد (cryo-EM) لتحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم أقل منميكرومتر 1,2. يتم تطبيق البلورات على شبكات المجهر الإلكتروني القياسي (TEM) ويتم تجميدها إما عن طريق الغطس في الإيثان السائل أو النيتروجين السائل. ثم يتم تحميل الشبكات في TEM تعمل في درجات حرارة مبردة. توجد البلورات على الشبكة ويتم فحصها للتأكد من جودة الحيود الأولية. الدوران المستمر يتم جمع بيانات MicroED من مجموعة فرعية من البلورات التي تم فحصها ، حيث يتم حفظ البيانات باستخدام كاميرا سريعة كفيلم3. يتم تحويل هذه الأفلام إلى تنسيق بلوري قياسي ومعالجتها بشكل متطابق تقريبا كتجربة علم البلورات بالأشعة السينية4.
تم تطوير MicroED في الأصل للتحقيق في بلورات البروتينالدقيقة 1,2. يؤدي عنق الزجاجة في علم بلورات البروتين إلى نمو بلورات كبيرة ومرتبة جيدا لتجارب حيود الأشعة السينية السنكروترونية التقليدية. نظرا لأن الإلكترونات تتفاعل مع أوامر المادة ذات الحجم الأقوى من الأشعة السينية ، فإن قيود حجم البلورة اللازمة لإنتاج حيود يمكن اكتشافه أصغر بكثير5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نسبة أحداث التشتت المرنة إلى غير المرنة أكثر ملاءمة للإلكترونات ، مما يشير إلى أنه يمكن جمع المزيد من البيانات المفيدة مع تعرض إجمالي أصغر5. سمحت التطورات المستمرة بجمع بيانات MicroED من البلورات الدقيقةالأكثر تحديا 6،7،8،9.
في الآونة الأخيرة ، ثبت أن MicroED أداة قوية لتحديد هياكل المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة من المواد غير المتبلورة على ما يبدو10،11،12،13. يمكن أن تأتي هذه المساحيق مباشرة من زجاجة كاشف تم شراؤها ، أو عمود تنقية ، أو حتى من سحق حبوب منع الحمل إلى مسحوق ناعم10. تبدو هذه المساحيق غير متبلورة بالعين ، ولكنها قد تكون إما مكونة بالكامل من بلورات نانوية أو تحتوي فقط على كميات ضئيلة من الرواسب البلورية النانوية في جزء غير بلوري غير متبلور أكبر. يعد تطبيق المادة على الشبكة أمرا سهلا ، وقد تكون الخطوات اللاحقة لتحديد الكريستال والغربلة وجمع البيانات مؤتمتة في المستقبلالقريب 14. في حين أن البعض الآخر قد يستخدم طرقا مختلفة لإعداد العينات وجمع البيانات ، هنا يتم تفصيل البروتوكولات التي تم تطويرها واستخدامها في مختبر Gonen لإعداد عينات من الجزيئات الصغيرة ل MicroED ولجمع البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة ما يكون إعداد العينة عملية تكرارية ، حيث يتم إجراء التحسينات بعد جلسات الفحص وجمع البيانات. بالنسبة لعينات الجزيئات الصغيرة ، غالبا ما يكون من الحكمة أولا محاولة تحضير الشبكة دون تفريغ الشبكات المتوهجة ، نظرا لأن العديد من المستحضرات الصيدلانية تميل إلى أن تكون كارهة للماء…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم مختبر جونين بأموال من معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
