छोटे अणुओं का माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन
Summary
यहां, हम माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) प्रयोगों के लिए छोटे अणु क्रिस्टल के पाउडर तैयार करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में विकसित प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।
Abstract
माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) प्रयोगों के लिए छोटे अणु के नमूने तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित है। माइक्रोईडी को मानक इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) उपकरणों का उपयोग करके प्रोटीन और छोटे अणुओं की संरचनाओं को हल करने के लिए विकसित किया गया है। इस तरह, छोटे अणु, पेप्टाइड्स, घुलनशील प्रोटीन और झिल्ली प्रोटीन हाल ही में उच्च संकल्प के लिए निर्धारित किए गए हैं। एक उदाहरण के रूप में दवा कार्बामाज़ेपिन का उपयोग करके छोटे अणु फार्मास्यूटिकल्स के ग्रिड तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किए गए हैं। स्क्रीनिंग और डेटा एकत्र करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं। समग्र प्रक्रिया में अतिरिक्त कदम, जैसे डेटा एकीकरण, संरचना निर्धारण और शोधन कहीं और प्रस्तुत किए जाते हैं। छोटे अणु ग्रिड तैयार करने के लिए आवश्यक समय 30 मिनट से कम होने का अनुमान है।
Introduction
माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) एक इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) विधि है जो उप-माइक्रोमीटर आकार के क्रिस्टल 1,2 से परमाणु संकल्प संरचनाओं को निर्धारित करती है। क्रिस्टल को मानक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) ग्रिड पर लागू किया जाता है और तरल ईथेन या तरल नाइट्रोजन में गिरकर जमे हुए होते हैं। ग्रिड को तब क्रायोजेनिक तापमान पर संचालित टीईएम में लोड किया जाता है। क्रिस्टल ग्रिड पर स्थित होते हैं और प्रारंभिक विवर्तन गुणवत्ता के लिए जांच की जाती है। निरंतर रोटेशन माइक्रोईडी डेटा स्क्रीन किए गए क्रिस्टल के उप-समूह से एकत्र किया जाता है, जहां डेटा को मूवी 3 के रूप में तेज कैमरे का उपयोग करके सहेजा जाताहै। इन फिल्मों को एक मानक क्रिस्टलोग्राफिक प्रारूप में परिवर्तित किया जाता है और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रयोग 4 के रूप में लगभग समान रूप से संसाधित कियाजाता है।
माइक्रोईडी मूल रूप से प्रोटीन माइक्रोक्रिस्टल 1,2 की जांच के लिए विकसित किया गया था। प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में एक अड़चन पारंपरिक सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए बड़े, अच्छी तरह से आदेशित क्रिस्टल बढ़ रही है। चूंकि इलेक्ट्रॉन एक्स-रे की तुलना में मजबूत परिमाण के पदार्थ आदेशों के साथ बातचीत करते हैं, पता लगाने योग्य विवर्तन का उत्पादन करने के लिए आवश्यक क्रिस्टल आकार की सीमाएं काफीछोटी हैं। इसके अतिरिक्त, लोचदार से इनलेस्टिक प्रकीर्णन घटनाओं का अनुपात इलेक्ट्रॉनों के लिए अधिक अनुकूल है, यह सुझाव देते हुए कि अधिक उपयोगी डेटा को छोटे समग्र जोखिम के साथ एकत्र किया जा सकताहै। निरंतर विकास ने माइक्रोईडी डेटा को सबसे चुनौतीपूर्ण माइक्रोक्रिस्टल 6,7,8,9 से एकत्र करने की अनुमति दी है।
हाल ही में, माइक्रोईडी को स्पष्ट रूप से अनाकार सामग्री10,11,12,13 से छोटे अणु फार्मास्यूटिकल्स की संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण दिखाया गया है। ये पाउडर सीधे खरीदे गए अभिकर्मक की बोतल, एक शुद्धिकरण स्तंभ, या यहां तक कि एक गोली को एक महीन पाउडर10 में कुचलने से भी आ सकते हैं। ये पाउडर आंखों से अनाकार दिखाई देते हैं, लेकिन या तो पूरी तरह से नैनोक्रिस्टल से बने हो सकते हैं या केवल अधिक गैर-क्रिस्टलीय, अनाकार अंश में नैनोक्रिस्टलाइन जमा की मात्रा का पता लगाते हैं। ग्रिड के लिए सामग्री का अनुप्रयोग आसान है, और क्रिस्टल पहचान, स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह के बाद के चरणों को निकट भविष्य में स्वचालित भी किया जा सकताहै। जबकि अन्य नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग कर सकते हैं, यहां माइक्रोईडी के लिए छोटे अणुओं के नमूने तैयार करने और डेटा संग्रह के लिए गोनेन प्रयोगशाला में विकसित और उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल विस्तृत हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
नमूना तैयारी आम तौर पर एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया है, जहां स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह के सत्रों के बाद अनुकूलन किए जाते हैं। छोटे अणु के नमूनों के लिए, ग्रिड को चमक-निर्वहन के बिना पहले ग्रिड तैयार करने का…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
गोनेन लैब हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट से धन द्वारा समर्थित है। इस अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ पी 41 जीएम 136508 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
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