Summary
Her beskriver vi prosedyrene utviklet i vårt laboratorium for fremstilling av pulver av småmolekylære krystaller for mikrokrystallelektrondiffraksjon (MicroED) eksperimenter.
Abstract
En detaljert protokoll for fremstilling av små molekylprøver for mikrokrystallelektrondiffraksjon (MicroED) eksperimenter er beskrevet. MicroED er utviklet for å løse strukturer av proteiner og små molekyler ved hjelp av standard elektronkryomikroskopi (cryo-EM) utstyr. På denne måten har små molekyler, peptider, oppløselige proteiner og membranproteiner nylig blitt bestemt til høye oppløsninger. Protokoller presenteres her for å forberede rutenett av småmolekylære legemidler ved bruk av stoffet karbamazepin som et eksempel. Protokoller for screening og innsamling av data presenteres. Flere trinn i den generelle prosessen, for eksempel dataintegrering, strukturbestemmelse og forbedring, presenteres andre steder. Tiden det tar å klargjøre småmolekylære rister er estimert til å være mindre enn 30 min.
Introduction
Mikrokrystallelektrondiffraksjon (MicroED) er en elektronkryomikroskopi (kryo-EM) metode for bestemmelse av atomoppløsningsstrukturer fra krystallermed submikrometerstørrelse 1,2. Krystaller påføres standard transmisjonselektronmikroskop (TEM) gitter og fryses ved enten å stupe inn i flytende etan eller flytende nitrogen. Rutenett lastes deretter inn i en TEM som opererer ved kryogene temperaturer. Krystaller er plassert på rutenettet og skjermet for innledende diffraksjonskvalitet. Kontinuerlig rotasjon MicroED-data samles inn fra en delmengde av de skjermede krystallene, der dataene lagres ved hjelp av et raskt kamera som en film3. Disse filmene konverteres til et standard krystallografisk format og behandles nesten identisk som et røntgenkrystallografieksperiment4.
MicroED ble opprinnelig utviklet for å undersøke proteinmikrokrystaller 1,2. En flaskehals i proteinkrystallografi vokser store, velordnede krystaller for tradisjonelle synkrotronrøntgendiffraksjonseksperimenter. Som elektroner interagerer med materieordener av størrelse sterkere enn røntgenstråler, er begrensningene av krystallstørrelsen som trengs for å produsere detekterbar diffraksjon betydelig mindre5. I tillegg er forholdet mellom elastiske og uelastiske spredningshendelser gunstigere for elektroner, noe som tyder på at mer nyttige data kan samles med en mindre total eksponering5. Konstant utvikling har gjort det mulig å samle inn MicroED-data fra de mest utfordrende mikrokrystallene 6,7,8,9.
Nylig har MicroED vist seg å være et kraftig verktøy for å bestemme strukturer av småmolekylære legemidler fra tilsynelatende amorfe materialer10,11,12,13. Disse pulverene kan komme rett fra en flaske kjøpt reagens, en rensekolonne, eller til og med fra å knuse en pille til et fint pulver10. Disse pulverene virker amorfe ved øyet, men kan enten være helt sammensatt av nanokrystaller eller bare inneholde spor av nanokrystallinske avsetninger i en større ikke-krystallinsk, amorf fraksjon. Påføring av materialet til rutenettet er lettvint, og de påfølgende trinnene med krystallidentifikasjon, screening og datainnsamling kan til og med bli automatisert i nær fremtid14. Mens andre kan bruke forskjellige metoder for prøvepreparering og datainnsamling, er protokollene utviklet og brukt i Gonen-laboratoriet for fremstilling av prøver av små molekyler for MicroED og for datainnsamling detaljert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prøvepreparering er vanligvis en iterativ prosess, der optimaliseringer gjøres etter økter med screening og datainnsamling. For småmolekylære prøver er det ofte klokt å først forsøke klargjøring av nettet uten å glødetømme ristene, siden mange legemidler har en tendens til å være hydrofobe10,11. Hvis ristene har for få nanokrystallinske avsetninger, er det en god ide å prøve igjen etter først å ha utladet ristene. Det kan være slik at krystal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonen-laboratoriet støttes av midler fra Howard Hughes Medical Institute. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
