Mikrokristallelektrondiffraktion av små molekyler
Summary
Här beskriver vi de procedurer som utvecklats i vårt laboratorium för framställning av pulver av småmolekylära kristaller för mikrokristallelektrondiffraktion (MicroED) experiment.
Abstract
Ett detaljerat protokoll för beredning av småmolekylära prover för mikrokristallelektrondiffraktionsexperiment (MicroED) beskrivs. MicroED har utvecklats för att lösa strukturer av proteiner och små molekyler med hjälp av standard elektronkryomikroskopi (kryo-EM) utrustning. På detta sätt har små molekyler, peptider, lösliga proteiner och membranproteiner nyligen bestämts till höga upplösningar. Protokoll presenteras här för att förbereda galler av småmolekylära läkemedel med läkemedlet karbamazepin som exempel. Protokoll för screening och insamling av data presenteras. Ytterligare steg i den övergripande processen, till exempel dataintegrering, strukturbestämning och förfining presenteras på annat håll. Den tid som krävs för att förbereda småmolekylära nät uppskattas till mindre än 30 minuter.
Introduction
Mikrokristallelektrondiffraktion (MicroED) är en elektronkryomikroskopimetod (kryo-EM) för bestämning av atomupplösningsstrukturer från submikrometerstora kristaller 1,2. Kristaller appliceras på standardtransmissionselektronmikroskop (TEM) galler och fryses genom att antingen kasta sig i flytande etan eller flytande kväve. Galler laddas sedan i en TEM som arbetar vid kryogena temperaturer. Kristaller är placerade på gallret och screenade för initial diffraktionskvalitet. Kontinuerlig rotation MicroED-data samlas in från en delmängd av de skärmade kristallerna, där data sparas med hjälp av en snabb kamera som en film3. Dessa filmer konverteras till ett standardkristallografiskt format och bearbetas nästan identiskt som ett röntgenkristallografiexperiment4.
MicroED utvecklades ursprungligen för att undersöka proteinmikrokristaller 1,2. En flaskhals inom proteinkristallografi växer stora, välordnade kristaller för traditionella synkrotronröntgendiffraktionsexperiment. Eftersom elektroner interagerar med materieordningar som är starkare än röntgenstrålar är begränsningarna för kristallstorleken som behövs för att producera detekterbar diffraktion betydligt mindre5. Dessutom är förhållandet mellan elastiska och oelastiska spridningshändelser mer gynnsamt för elektroner, vilket tyder på att mer användbara data kan samlas in med en mindre total exponering5. Konstant utveckling har gjort det möjligt att samla in MicroED-data från de mest utmanande mikrokristallerna 6,7,8,9.
Nyligen har MicroED visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att bestämma strukturerna för småmolekylära läkemedel från uppenbarligen amorfa material 10,11,12,13. Dessa pulver kan komma direkt från en flaska köpt reagens, en reningskolonn eller till och med från att krossa ett piller till ett fint pulver10. Dessa pulver verkar amorfa för ögat, men kan antingen helt bestå av nanokristaller eller bara innehålla spårmängder av nanokristallina avlagringar i en större icke-kristallin, amorf fraktion. Applicering av materialet på nätet är enkelt, och de efterföljande stegen för kristallidentifiering, screening och datainsamling kan till och med automatiseras inom en snar framtid14. Medan andra kan använda olika metoder för provberedning och datainsamling, beskrivs här de protokoll som utvecklats och används i Gonen-laboratoriet för att förbereda prover av små molekyler för MicroED och för datainsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Provberedning är vanligtvis en iterativ process där optimeringar görs efter sessioner med screening och datainsamling. För småmolekylära prover är det ofta klokt att först försöka förbereda galler utan att lysa ur gallren, eftersom många läkemedel tenderar att vara hydrofoba10,11. Om gallren har för få nanokristallina avlagringar är det en bra idé att försöka igen efter att näten först glödtömts. Det kan vara så att kristallerna från frys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonens laboratorium stöds av medel från Howard Hughes Medical Institute. Denna studie stöddes av National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
