Kvantifiering i realtid av reaktiva syrearter i neutrofiler infekterade med meningitisk escherichia coli
Summary
Escherichia coli är den främsta orsaken till neonatal gramnegativ bakteriell hjärnhinneinflammation. Under bakterieinfektionen spelar reaktiva syrearter som produceras av neutrofiler en viktig bakteriedödande roll. Här introducerar vi en metod för att upptäcka de reaktiva syrearterna i neutrofiler som svar på hjärnhinneinflammation E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) är de vanligaste gramnegativa bakterierna som orsakar neonatal hjärnhinneinflammation. Förekomsten av bakteriemi och bakteriell penetration genom blod – hjärnbarriären är oumbärliga steg för utvecklingen av E. coli hjärnhinneinflammation. Reaktiva syrearter (ROS) representerar de viktigaste bakteriedödande mekanismerna hos neutrofiler för att förstöra de invaderade patogenerna. I detta protokoll kvantifierades den tidsberoende intracellulära ROS-produktionen i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli med fluorescerande ROS sonder upptäckt av en realtid fluorescens microplate läsare. Denna metod kan också tillämpas vid bedömning av produktion av försäljning i däggdjursceller under interaktioner mellan patogen och värd.
Introduction
Neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation är en vanlig pediatrisk infektionssjukdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1-kapsel är den vanligaste gramnegativa patogenen som orsakar neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation, som står för cirka 80% av den totalaincidensen 1,2,3. Trots framstegen inom antimikrobiell kemoterapi och stödjande vård är bakteriell hjärnhinneinflammation fortfarande ett av de mest förödande tillstånden med hög sjuklighet ochdödlighet 4.
Förekomsten av neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation börjar vanligtvis med bakteriemi orsakad av inträdet av patogena bakterier i perifera cirkulationen från de nyföddas lokala skador, följt av penetration genom blod – hjärnbarriären (BBB) i hjärnan, vilket resulterar i inflammation i hjärnhinnorna4. Uppkomsten av bakteriemi beror på interaktionen mellan bakterier och värd immunceller inklusive neutrofiler och makrofager, etc. Neutrofiler, som står för ~ 50-70% av vita blodkroppar, är den första försvarslinjen mot bakteriella infektioner5,6. Under invasionen av bakterier rekryteras de aktiverade neutrofilerna till de smittsamma platserna och släpper ut reaktiva syrearter (ROS) inklusive superoxidanjon, väteperoxid, hydroxylradikaler och singlet syre7. ROS genomgår redoxreaktioner med bakteriernas cellmembran, nukleinsyramolekyler och proteiner, vilket resulterar i skador och död hos de invaderande bakterierna8. Mitokondrierna är huvudplatsen för ROS-produktion i eukaryota celler och olika oxidaser (t.ex. nikotinamid adenin dinukleotidfosfat (NADPH) oxidaskomplex, lipoxygenassystem, proteinkinas C och cyklooxygenassystem) förmedlar produktionen av ROS9,10. Realtidsmätningen av produktionen av ROS, som representerar den primära antimikrobiella mekanismen i neutrofiler, är en användbar metod för att studera värdförsvar under bakterie-värdinteraktionen.
I detta protokoll kvantifierades den tidsberoende ROS-produktionen i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli med en fluorescerande ROS sond DHE, upptäckt av en realtid fluorescens microplate läsare. Denna metod kan också tillämpas vid bedömningen av produktionen av försäljning i andra däggdjursceller under interaktionen mellan patogen och värd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrofiler fungerar som den vanligaste komponenten i vita blodkroppar i människans blodcirkulation. De är viktiga effektorceller i det medfödda mänskliga immunsystemet, som bygger den första försvarslinjen mot invasionen av patogener11. Generationen av ROS representerar en av de viktigaste bakteriedödande mekanismerna för neutrofiler efter faagocytos11. Nyligen genomförda studier har visat att en nätliknande struktur som frigörs av en neutrofil som kallas neutro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) och Programmet för framstående professor i Liaoning-provinsen (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
