Summary

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Published: April 20, 2021
doi:

Summary

Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) is de meest voorkomende Gram-negatieve bacterie die neonatale meningitis veroorzaakt. Het optreden van bacteriëmie en bacteriële penetratie door de bloed – hersenbarrière zijn onmisbare stappen voor de ontwikkeling van E. coli meningitis. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vertegenwoordigen de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen om de binnengevallen pathogenen te vernietigen. In dit protocol werd de tijdsafhankelijke intracellulaire ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met behulp van fluorescerende ROS-sondes die werden gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in zoogdiercellen tijdens interacties tussen pathogene gastheer en gastheer.

Introduction

Neonatale bacteriële meningitis is een veel voorkomende pediatrische infectieziekte. Escherichia coli (E. coli) met een K1 capsule is de meest voorkomende Gram-negatieve ziekteverwekker die neonatale bacteriële meningitis veroorzaakt, goed voor ongeveer 80% van de totale incidentie1,2,3. Ondanks de vooruitgang in de antimicrobiële chemotherapie en ondersteunende zorg, is bacteriële meningitis nog steeds een van de meest verwoestende aandoeningen met hoge morbiditeit enmortaliteit 4.

Het optreden van neonatale bacteriële meningitis begint meestal met bacteriëmie veroorzaakt door het binnendringen van pathogene bacteriën in de perifere circulatie van de lokale laesies van de pasgeborenen, gevolgd door penetratie door de bloed – hersenbarrière (BBB) in de hersenen, wat resulteert in de ontsteking van de hersenvliezen4. Het begin van bacteriëmie hangt af van de interactie tussen bacteriën en gastheerimmuuncellen, waaronder neutrofielen en macrofagen, enz. Neutrofielen, die goed zijn voor ~ 50-70% van de witte bloedcellen, zijn de eerste verdedigingslinie tegen bacteriële infecties5,6. Tijdens de invasie van bacteriën worden de geactiveerde neutrofielen gerekruteerd naar de besmettelijke locaties en geven reactieve zuurstofsoorten (ROS) vrij, waaronder het superoxide anion, waterstofperoxide, hydroxylradicalen en singlet zuurstof7. Ros ondergaat redoxreacties met het celmembraan, nucleïnezuurmoleculen en proteïnen van de bacteriën, resulterend in het letsel en de dood van de binnenvallende bacteriën8. De mitochondriën is de belangrijkste plaats van ROS-productie in eukaryotische cellen, en verschillende oxidasen (bijv. nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) oxidasecomplex, lipoxygenasesysteem, eiwitkinase C en cyclooxygenasesysteem) bemiddelen de productie van ROS9,10. De real-time meting van de productie van ROS, die het primaire antimicrobiële mechanisme bij neutrofielen vertegenwoordigt, is een nuttige methode voor het bestuderen van gastheerverdediging tijdens de interactie tussen bacteriën en gastheer.

In dit protocol werd de tijdsafhankelijke ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met een fluorescerende ROS-sonde DHE, gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in andere zoogdiercellen tijdens de interactie tussen ziekteverwekker en gastheer.

Protocol

Perifeer bloed van vrijwilligers dat in dit onderzoek werd toegepast, werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de eerste Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2). 1. Bereiding van reagentia en kweekmedium Bereid de rode bloedcellysebuffer voor door 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3,37,2 mg Na2EDTA toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water en de pH aan te passen tot 7,2-7,4. Verwijder de bacteriën door filtratie met 0,22 μm…

Representative Results

Met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, werden de neutrofielen geïsoleerd uit menselijk perifeer bloed en geladen met fluorescentiesonde DHE om de veranderingen van ros-niveaus als reactie op E44-infectie te detecteren. Hier leveren we representatieve gegevens die de ROS-productie aantonen die wordt opgeroepen door E44-stam, bepaald door een microplaatlezer in realtime. Door E44-stammen toe te voegen bij een MOI van 100 namen de ROS-niveaus onmiddellijk toe en vertoonden zij een continue opwaart…

Discussion

Neutrofielen fungeren als de meest voorkomende component van witte bloedcellen in de menselijke bloedsomloop. Het zijn belangrijke effectorcellen in het aangeboren menselijke immuunsysteem, dat de eerste verdedigingslinie bouwt tegen de invasie van ziekteverwekkers11. De generatie van ROS vertegenwoordigt een van de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen na fagocytose11. Recente studies hebben aangetoond dat een netachtige structuur die vrijkomt door een…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) en het Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35).

Materials

15 mL polypropylene conical centrifuge tubes KIRGEN KG2611
96-well plate Corning 3025
Agar DINGGUO DH010-1.1
Autuomated cell counter Bio-rad 508BR03397
Biological Safety Carbinet Shanghai Lishen Hfsafe-1200Lcb2
Brain heart infusion BD 237500
CD16 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-701
Centrifuge Changsha Xiangyi TDZ5-WS
Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Dihydroethidium (DHE) MedChemExpress 104821-25-2
Fetal bovine serum Cellmax SA211.02
Incubator Heraeus Hera Cell
MACS separation buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Beyoitme S1819-1mg
QuadroMACS separation Unit Miltenyi Biotec 130-090-976
Rifampicin Solarbio 13292-46-1
RPMI1640 medium Sangon Biotech E600027-0500
Thermostatic shaker Shanghai Zhicheng ZWY-100D
Trypton OXOID LP0042
Yeast extract OXOID LP0021

References

  1. Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
  2. Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
  3. Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
  4. Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
  5. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  7. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  8. Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
  9. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  10. Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
  11. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
  13. Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
  14. Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
  15. Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
  16. Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
  17. Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
  18. Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
  19. Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
  20. Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  21. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  22. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  23. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  24. Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).

Play Video

Cite This Article
Zhang, X., An, M., Zhao, W. Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (170), e62314, doi:10.3791/62314 (2021).

View Video