Quantification en temps réel des espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles infectés par escherichia coli méningitique
Summary
Escherichia coli est la principale cause de méningite bactérienne gramnégative néonatale. Pendant l’infection bactérienne, les espèces réactives d’oxygène produites par les neutrophiles jouent un rôle bactérien majeur. Ici, nous introduisons une méthode pour détecter les espèces réactives d’oxygène dans les neutrophiles en réponse à la méningite E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) est la bactérie gramnégative la plus commune causant la méningite néonatale. L’apparition de la bactériémie et la pénétration bactérienne par la barrière céphalo-encéphalique sont des étapes indispensables au développement de la méningite à E. coli. Les espèces réactives d’oxygène (ROS) représentent les principaux mécanismes bactéricides des neutrophiles pour détruire les pathogènes envahis. Dans ce protocole, la production intracellulaire de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique a été quantifiée à l’aide de sondes ROS fluorescentes détectées par un lecteur de microplaque de fluorescence en temps réel. Cette méthode peut également être appliquée à l’évaluation de la production de ROS dans les cellules mammifères lors des interactions pathogènes-hôtes.
Introduction
La méningite bactérienne néonatale est une maladie infectieuse pédiatrique courante. Escherichia coli (E. coli) avec une capsule K1 est l’agent pathogène gramnégatif le plus commun causant la méningite bactérienne néonatale, représentant environ 80% de l’incidence totale1,2,3. Malgré les progrès de la chimiothérapie antimicrobienne et des soins de soutien, la méningite bactérienne reste l’une des affections les plus dévastatrices avec une morbidité et une mortalitéélevées 4.
L’occurrence de la méningite bactérienne néonatale commence habituellement par la bactériémie provoquée par l’entrée des bactéries pathogènes dans la circulation périphérique des lésions locales des nouveau-nés, suivie de la pénétration par la barrière de sang-cerveau (BBB) dans le cerveau, ayant pour résultat l’inflammation des méninges4. L’apparition de la bactériémie dépend de l’interaction entre les bactéries et les cellules immunitaires hôtes, y compris les neutrophiles et les macrophages, etc. Les neutrophiles, qui représentent ~50-70% des globules blancs, sont la première ligne de défense contre les infections bactériennes5,6. Pendant l’invasion des bactéries, les neutrophiles activés sont recrutés dans les sites infectieux et libèrent des espèces réactives d’oxygène (ROS), y compris l’anion de superoxyde, le peroxyde d’hydrogène, les radicaux hydroxyles et l’oxygène singlet7. Le ROS subit des réactions de redox avec la membrane cellulaire, les molécules d’acide nucléique et les protéines des bactéries, ayant pour résultat la blessure et la mort des bactéries envahissantes8. Les mitochondries sont le site principal de la production de ROS dans les cellules eucaryotes, et divers oxidases (par exemple, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complexe, système de lipoxygénase, protéine kinase C et système de cyclooxygénase) médiation la production de ROS9,10. La mesure en temps réel de la production de ROS, représentant le mécanisme antimicrobien primaire dans les neutrophiles, est une méthode utile pour étudier la défense de l’hôte pendant l’interaction bactéries-hôte.
Dans ce protocole, la production de ROS dépendante du temps dans les neutrophiles infectés par E. coli méningitique a été quantifiée par une sonde ROS fluorescente DHE, détectée par un lecteur de microplaque de fluorescence en temps réel. Cette méthode peut également être appliquée à l’évaluation de la production de ROS dans d’autres cellules mammifères au cours de l’interaction pathogène-hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les neutrophiles agissent comme la composante la plus abondante des globules blancs dans la circulation sanguine humaine. Ce sont des cellules effectrices importantes dans le système immunitaire humain inné, qui construit la première ligne de défense contre l’invasion des pathogènes11. La génération de ROS représente l’un des principaux mécanismes bactéricides des neutrophiles suivant la phagocytose11. Des études récentes ont montré qu’une structure en fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) et le Programme du professeur émérite de la province du Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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