मेनिंगिटिक एस्चेरिचिया कोलाई से संक्रमित न्यूट्रोफिल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का वास्तविक समय मात्राकरण
Summary
एस्चेरिचिया कोलाई नवजात ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल मेनिनजाइटिस का प्रमुख कारण है। बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान, न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां एक प्रमुख जीवाणु की भूमिका निभाती हैं। यहां हम दिमागी बुखार ई कोलाईके जवाब में न्यूट्रोफिल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक विधि पेश करते हैं ।
Abstract
एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई)सबसे आम ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया है जो नवजात दिमागी बुखार का कारण बनता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा के माध्यम से जीवाणु और बैक्टीरियल प्रवेश की घटना ई कोलाई दिमागी बुखार के विकास के लिए अपरिहार्य कदम हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) आक्रमण किए गए रोगजनकों को नष्ट करने के लिए न्यूट्रोफिल के प्रमुख जीवाणु तंत्र का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, मेनिंगिटिक ई. कोलाई से संक्रमित न्यूट्रोफिल में समय पर निर्भर इंट्रासेलुलर आरओएस उत्पादन को वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा पता लगाया गया फ्लोरोसेंट आरओ जांच का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। इस विधि को रोगजनक-मेजबान बातचीत के दौरान स्तनधारी कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन के आकलन पर भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
नवजात जीवाणु दिमागी बुखार एक आम बाल चिकित्सा संक्रामक रोग है। के 1 कैप्सूल के साथ एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई)सबसे आम ग्राम-नकारात्मक रोगजनक है जो नवजात जीवाणु दिमागी बुखार का कारण बनता है, जो कुल घटना1,2,3का लगभग 80% है। एंटीमाइक्रोबियल कीमोथेरेपी और सहायक देखभाल में प्रगति के बावजूद, बैक्टीरियल दिमागी बुखार अभी भी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर4के साथ सबसे विनाशकारी स्थितियों में से एक है।
नवजात जीवाणु दिमागी बुखार की घटना आमतौर पर नवजात शिशुओं के स्थानीय घावों से परिधीय परिसंचरण में रोगजनक बैक्टीरिया के प्रवेश के कारण जीवाणु के साथ शुरू होती है, जिसके बाद मस्तिष्क में रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के माध्यम से प्रवेश होता है, जिसके परिणामस्वरूप मेनिंग4की सूजन होती है। जीवाणु की शुरुआत बैक्टीरिया और मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत पर निर्भर करती है जिसमें न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज आदि शामिल हैं। न्यूट्रोफिल, जो सफेद रक्त कोशिकाओं के ~ 50-70% के लिए खाते हैं, जीवाणु संक्रमण5,6के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति हैं। बैक्टीरिया के आक्रमण के दौरान, सक्रिय न्यूट्रोफिल संक्रामक स्थलों में भर्ती किए जाते हैं और सुपरऑक्साइड एनियन, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स और सिंगलेट ऑक्सीजन7सहित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को छोड़ते हैं। आरओएस कोशिका झिल्ली, न्यूक्लिक एसिड अणुओं और बैक्टीरिया के प्रोटीन के साथ रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप हमलावर बैक्टीरिया8की चोट और मृत्यु हो जाती है। माइटोकॉन्ड्रिया यूकेरियोटिक कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन का मुख्य स्थल है, और विभिन्न ऑक्सीडास (जैसे, निकोटीनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) ऑक्सीडेस कॉम्प्लेक्स, लिपोक्सीजेनेज सिस्टम, प्रोटीन किनेज सी और साइक्लॉक्सीजेनेज सिस्टम) आरओएस9,10के उत्पादन में मध्यस्थता करते हैं। आरओएस के उत्पादन का वास्तविक समय माप, न्यूट्रोफिल में प्राथमिक रोगाणुरोधी तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है, बैक्टीरिया-मेजबान बातचीत के दौरान मेजबान रक्षा का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है।
इस प्रोटोकॉल में, मेनिंगिटिक ई. कोलाई से संक्रमित न्यूट्रोफिल में समय पर निर्भर आरओएस उत्पादन को फ्लोरोसेंट आरओएस प्रोब डीएचई के साथ निर्धारित किया गया था, जो वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा पता लगाया गया था। इस विधि को रोगजनक-मेजबान बातचीत के दौरान अन्य स्तनधारी कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन के आकलन पर भी लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूट्रोफिल मानव रक्त परिसंचरण में सफेद रक्त कोशिकाओं के सबसे प्रचुर घटक के रूप में कार्य करते हैं। वे जन्मजात मानव प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण प्रभावक कोशिकाएं हैं, जो रोगजनकों के आक्रमण के ख…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31670845, 31870832, 32000811) और लियानिंग प्रांत के प्रतिष्ठित प्रोफेसर (एलजेएच2018-35) के कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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