Sanntids kvantifisering av reaktive oksygenarter i nøytrofiler smittet med meningittisk escherichia coli
Summary
Escherichia coli er den ledende årsaken til neonatal Gram-negativ bakteriell meningitt. Under bakterieinfeksjonen spiller reaktive oksygenarter produsert av nøytrofiler en stor bakteriedrepende rolle. Her introduserer vi en metode for å oppdage de reaktive oksygenarter i nøytrofiler som svar på meningitt E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) er de vanligste Gram-negative bakteriene som forårsaker neonatal meningitt. Forekomsten av bakterieemi og bakteriell penetrasjon gjennom blod-hjernebarrieren er uunnværlige trinn for utvikling av E. coli meningitt. Reaktive oksygenarter (ROS) representerer de viktigste bakteriedrepende mekanismene til nøytrofiler for å ødelegge de invaderte patogenene. I denne protokollen ble den tidsavhengige intracellulære ROS-produksjonen i nøytrofiler infisert med meningittisk E. coli kvantifisert ved hjelp av fluorescerende ROS-sonder oppdaget av en sanntids fluorescensmikroplateleser. Denne metoden kan også brukes på vurdering av ROS-produksjon i pattedyrceller under patogen-vert interaksjoner.
Introduction
Neonatal bakteriell meningitt er en vanlig pediatrisk smittsom sykdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1 kapsel er det vanligste Gram-negative patogenet som forårsaker neonatal bakteriell meningitt, som står for ca 80% av den totale forekomsten1,2,3. Til tross for fremskrittene i antimikrobiell kjemoterapi og støttende omsorg, er bakteriell meningitt fortsatt en av de mest ødeleggende forholdene med høy sykelighet ogdødelighet 4.
Forekomsten av neonatal bakteriell meningitt begynner vanligvis med bakterieemi forårsaket av innføring av patogene bakterier i perifer sirkulasjon fra de nyfødtes lokale lesjoner, etterfulgt av penetrasjon gjennom blod-hjernebarrieren (BBB) inn i hjernen, noe som resulterer i betennelse i meningene4. Utbruddet av bakterier avhenger av samspillet mellom bakterier og vert av immunceller, inkludert nøytrofiler og makrofager, etc. Nøytrofiler, som står for ~ 50-70% av hvite blodlegemer, er den første forsvarslinjen mot bakterielle infeksjoner5,6. Under invasjonen av bakterier rekrutteres de aktiverte nøytrofiler til de smittsomme stedene og frigjør reaktive oksygenarter (ROS) inkludert superoksidanion, hydrogenperoksid, hydroksylradikaler og singlet oksygen7. ROS gjennomgår redoksreaksjoner med cellemembranen, nukleinsyremolekyler og proteiner av bakteriene, noe som resulterer i skade og død av de invaderende bakteriene8. Mitokondriene er hovedstedet for ROS-produksjon i eukaryote celler, og ulike oksider (f.eks. nikotinamid adenin dinukleotidfosfat (NADPH) oksidasekompleks, lipoksygenasesystem, proteinkinase C og cyclooxygenase system) formidler produksjonen av ROS9,10. Sanntidsmålingen av produksjonen av ROS, som representerer den primære antimikrobielle mekanismen i nøytrofiler, er en nyttig metode for å studere vertsforsvar under bakterievertens interaksjon.
I denne protokollen ble den tidsavhengige ROS-produksjonen i nøytrofiler infisert med meningittisk E. coli kvantifisert med en fluorescerende ROS-sonde DHE, oppdaget av en sanntids fluorescensmikroplateleser. Denne metoden kan også brukes på vurdering av ROS-produksjon i andre pattedyrceller under patogenvertsinteraksjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nøytrofiler fungerer som den mest tallrike komponenten av hvite blodlegemer i menneskelig blodsirkulasjon. De er viktige effektorceller i det medfødte menneskelige immunsystemet, som bygger den første forsvarslinjen mot invasjonen av patogener11. Genereringen av ROS representerer en av de viktigste bakteriedrepende mekanismene for nøytrofiler etter fagocytose11. Nyere studier har vist at en nettlignende struktur utgitt av en nøytrofil kalt nøytrofil ekstracellulær fe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) og program for fremragende professor i Liaoning-provinsen (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
