Количественная оценка видов реактивного кислорода в нейтрофилах, инфицированных менингитом Escherichia Coli в реальном времени
Summary
Escherichia coli является основной причиной неонатального грамотрицательных бактериального менингита. Во время бактериальной инфекции, реактивные виды кислорода, производимые нейтрофилов играют важную бактерицидную роль. Здесь мы представляем метод обнаружения реактивных видов кислорода в нейтрофилов в ответ на менингит E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) является наиболее распространенными грамотрицательных бактерий, вызывающих неонатальный менингит. Возникновение бактериемии и проникновение бактерий через геммозеозный барьер являются незаменимыми шагами для развития менингита кишечной палочки. Реактивные виды кислорода (ROS) представляют собой основные бактерицидные механизмы нейтрофилов для уничтожения вторгшихся патогенов. В этом протоколе, зависит от времени внутриклеточного производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с помощью флуоресцентных зондов ROS обнаружены в режиме реального времени флуоресценции микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.
Introduction
Неонатальный бактериальный менингит является распространенным детским инфекционным заболеванием. Escherichia coli (E. coli) с капсулой K1 является наиболее распространенным грам-отрицательным патогеном, вызывающим неонатальный бактериальный менингит, на который приходится около 80% от общейзаболеваемости 1,2,3. Несмотря на достижения в области антимикробной химиотерапии и поддерживающей помощи, бактериальный менингит по-прежнему является одним из самых разрушительных состояний с высокой заболеваемостью исмертностью 4.
Возникновение неонатального бактериального менингита обычно начинается с бактериемии, вызванной входом патогенных бактерий в периферическую циркуляцию от местных поражений новорожденных, а затем проникновение через геммозео-мозговой барьер (BBB) в мозг, в результате чего воспаление опоясывания4. Начало бактериемии зависит от взаимодействия между бактериями и иммунными клетками хозяина, включая нейтрофилы и макрофаги и т.д. Нейтрофилов, на которые приходится 50-70% белых кровяных телец, являются первой линией защиты отбактериальных инфекций 5,6. Во время вторжения бактерий, активированные нейтрофилов набираются в инфекционные сайты и высвобождают реактивные виды кислорода (ROS), включая супероксидный анион, перекись водорода, гидроксиловы радикалы и синглетныйкислород 7. ROS проходят редокс реакции с клеточной мембраны, молекулы нуклеиновой кислоты и белки бактерий, в результате чего травмы и смерти вторжениябактерий 8. Митохондрии является основным местом производства ROS в эукариотических клетках, и различные оксидазы (например, никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы комплекс, липоксигеназа системы, белка киназы C и циклоксигеназы системы) посредником производства ROS9,10. Измерение в режиме реального времени производства ROS, представляющего первичный противомикробный механизм в нейтрофилах, является полезным методом для изучения защиты хозяина во время взаимодействия бактерий-хозяина.
В этом протоколе, зависит от времени производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с флуоресцентным зондом ROS DHE, обнаруженный в режиме реального времени флуоресцентной микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в других клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нейтрофили действуют как наиболее распространенный компонент белых кровяных телец в крови человека. Они являются важными клетками-эффекторами в врожденной иммунной системе человека, которая строит первую линию защиты от вторжения патогенных микроорганизмов11. Поколение…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31670845, 31870832, 32000811) и Программой заслуженного профессора провинции Ляонин (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
