Bestämning av totala lipid- och lipidklasser i marina prover
Summary
Detta protokoll är för bestämning av lipider i havsvatten och biologiska exemplar. Lipider i filtrater extraheras med kloroform eller blandningar av kloroform och metanol när det gäller fasta ämnen. Lipidklasser mäts genom stång tunnskiktskromatografi med flamjoniseringsdetektering och deras summa ger det totala lipidinnehållet.
Abstract
Lipider består till stor del av kol och väte och ger därför en större specifik energi än andra organiska makromolekyler i havet. Som kol- och väterika är de också hydrofobiska och kan fungera som lösningsmedels- och absorptionsbärare för organiska föroreningar och kan därmed vara drivkrafter för förorenande bioackumulering i marina ekosystem. Deras hydrofoba natur underlättar deras isolering från havsvatten eller biologiska exemplar: marin lipidanalys börjar med provtagning och sedan extraktion i icke-polära organiska lösningsmedel, vilket ger en bekväm metod för deras separation från andra ämnen i en vattenmatris.
Om havsvatten har provtagits innebär det första steget vanligtvis separation i operativt definierade “upplösta” och “partikelgrupper” genom filtrering. Prover samlas in och lipider isoleras från provmatrisen vanligtvis med kloroform för verkligt upplöst materia och kolloider, och med blandningar av kloroform och metanol för fasta ämnen och biologiska prover. Sådana extrakt kan innehålla flera klasser från biogena och antropogena källor. Vid denna tidpunkt kan totala lipider och lipidklasser bestämmas. Total lipid kan mätas genom summering av individuellt bestämda lipidklasser som vanligtvis har separerats kromatografiskt. Tunnskiktskromatografi (TLC) med flamjoniseringsdetektering (FID) används regelbundet för kvantitativ analys av lipider från marina prover. TLC-FID tillhandahåller synoptisk lipidklassinformation och, genom summeringsklasser, en total lipidmätning.
Lipidklassinformation är särskilt användbar i kombination med mätningar av enskilda komponenter, t.ex. fettsyror och/eller steroler, efter att de släppts ut från lipidextrakt. Det stora utbudet av lipidstrukturer och funktioner innebär att de används brett i ekologisk och biogeokemisk forskning som bedömer ekosystemens hälsa och graden av påverkan av antropogena effekter. De har använts för att mäta ämnen av kostvärde till marina djur (t.ex. vattenfoder och/eller byten) och som en indikator på vattenkvaliteten (t.ex. kolväten).
Introduction
De metoder som beskrivs här gäller ämnen som definieras operativt som marina lipider. Denna definition är baserad på deras mottaglighet för vätske-vätskeutvinning i icke-polära organiska lösningsmedel, och det ger en bekväm metod för deras separation från andra ämnen i en vattenmatris. Deras hydrofoba natur underlättar deras isolering från havsvatten eller biologiska exemplar, liksom deras berikning och avlägsnande av salter och proteiner.
Mätningen av lipidinnehåll och dess sammansättning i marina organismer har varit av stort intresse för livsmedelsvävekologi, vattenbruksnäring och livsmedelsvetenskap i årtionden. Lipider är universella komponenter i levande organismer, fungerar som väsentliga molekyler i cellmembran, som viktiga källor till biotillgänglig energi, vilket ger värmeisolering och flytkraft och fungerar som signalmolekyler. Även om förfaranden för lipidbestämning inom andra områden har beskrivits väl, kräver deras användning med marina prover vanligtvis modifiering för att anpassa sig till fältförhållandena samt för att prov typ1.
För havsvattenprover kräver det första steget vanligtvis att de driftsdefinierade “upplösta” och “partikelfraktionerna” separeras, normalt genom filtrering (protokoll steg 1). Partikelfraktionen är vad som behålls av filtret, och porernas storlek är viktig för att definiera avskärningen2. Ofta när vi tar prover på partiklar vill vi relatera lipidkoncentrationer till totala masskoncentrationer, i vilket fall ett separat, mindre, prov (t.ex. 10 ml) måste tas för detta ändamål (protokoll steg 1, notera). För att få en korrekt massbestämning är det viktigt att lägga till ammoniumformat (35 g /L) i slutet av filtreringen.
Havsvattenstarratet från det större provet bör uppgå till mellan 250 ml och 1 L beroende på provtyp och utsättas för vätske-vätskeutvinning i en separatortratt (protokollsteg 2). Lipidernas hydrofoba natur innebär att de kan separeras från andra föreningar genom extraktion i ett icke-polärt lösningsmedel som kloroform. Ett tvåskiktssystem skapas där lipider delas upp i det organiska skiktet medan vattenlösliga komponenter stannar kvar i vattenskiktet.
Partikelprover på ett filter eller biologiska provexemplar extraheras med en modifierad folch et al. extraktion3, även med kloroform (protokollsteg 3). Återigen skapas ett organiskt/vattenhaltigt system där lipider delas upp i den organiska fasen, medan vattenlösliga molekyler förblir i vattenfasen och proteiner fälls ut. Faktum är att för fasta ämnen använder de flesta laboratorier någon variation av Folch et al. extraktion3-förfarandet som involverar kloroform och metanol. För filter är det första steget att homogenisera i 2 ml kloroform och 1 ml metanol.
Under extraktionen bör man vara noga med att skydda lipider från kemisk eller enzymatisk modifiering genom att hålla prover och lösningsmedel på is för att minska hydrolysering av esterbindning eller kolkolsoxidation av dubbelbindning. Vävnader och cellfetter är ganska väl skyddade av naturliga antioxidanter och genom compartmentalization4; Efter homogeniseringen av proverna kombineras dock lipider som är mer benägna att ändras, kemiskt eller enzymatiskt. Vissa lipider, såsom de flesta steroler, är mycket stabila, medan andra, såsom de som innehåller fleromättade fettsyror, är mer mottagliga för kemisk oxidation. Andra, såsom steroler med konjugerade dubbla bindningar, är benägna att oxidation katalyseras av ljus5. Efter extraktioner är lipider mycket mer mottagliga för kemisk oxidation, och prover bör lagras under en inert gas som kväve. En mild ström av kväve skulle också användas för att koncentrera extrakt.
Efter koncentrationen skulle lipider sedan normalt kvantifieras i bulk eftersom de är en viktig komponent i marina ekosystem som ger en hög koncentration av energi, mer än dubbelt så mycket som kJ/g kolhydrater och proteiner. De skulle alltid kvantifieras som enskilda komponenter: den omfattande analysen av lipider innebär i allmänhet separation i enklare kategorier, beroende på deras kemiska natur. Således innebär en fullständig analys att mäta totala lipider, lipidklasser och enskilda föreningar.
Total lipid kan bestämmas genom att ta summan av individuellt uppmätta lipidklasser åtskilda av kromatografi6. En marina lipid extrakt kan innehålla mer än ett dussin klasser från biogena och antropogena källor. Det stora utbudet av lipidstrukturer innebär att mycket information kan erhållas genom att bestämma enskilda grupper av strukturer. Lipidklasser individuellt, eller i vissa grupper, har använts för att signalera förekomst av vissa typer av organismer, liksom deras fysiologiska status och aktivitet2. De har också använts som en indikator på ursprunget för organiskt material, inklusive upplöst organiskt material (DOM) samt hydrofoba föroreningar.
Triacylglycerols, fosfolipider och steroler är bland de viktigare biogena lipidklasserna. De två första är biokemiskt besläktade eftersom de har en glycerol ryggrad till vilken två eller tre fettsyror är förestedade (figur 1). Triacylglycerols, tillsammans med vaxestrar är mycket viktiga lagringsämnen, medan andra fettsyrahaltiga lipidklasser som diacylglyceroler, fria fettsyror och monoacylglyceroler i allmänhet är mindre beståndsdelar. Fria fettsyror finns vid lägre koncentrationer i levande organismer, eftersom de omättade kan vara giftiga7. Steroler (både i sina fria och förestade former) och feta alkoholer ingår också bland de mindre polära lipiderna, medan glykolipider och fosfolipider är polära lipider. Polafetter har en hydrofil grupp, vilket möjliggör bildandet av lipidbilayers som finns i cellmembran. Fria steroler är också membranstrukturkomponenter, och när de tas i förhållande till triacylglyceroler ger de ett tillstånd eller näringsindex (TAG: ST) som har använts i stor utsträckning8. När de tas i förhållande till fosfolipider (ST: PL) kan de användas för att indikera växtens känslighet för salt: högre värden upprätthåller strukturell integritet och minskar membrangenomsläppligheten9. Inversen av detta förhållande (PL: ST) har studerats i tvåskaliga vävnader under temperaturanpassning10.
Marina lipidklasser kan separeras av tunnskiktskromatografi (TLC) på kiselgelbelagda stavar (protokollsteg 4) och sedan detekteras och kvantifieras genom flamjoniseringsdetektering (FID) i en automatisk FID-skanner. TLC/FID har blivit rutinmässigt använt för marina prover eftersom det snabbt tillhandahåller synoptiska lipidklassdata från små prover och genom att ta summan av alla klasser, ett värde för totala lipider. TLC/FID har genomgått en kvalitetssäkringsbedömning (QA) och har visat sig uppfylla de standarder som krävs för konsekvent extern kalibrering, låga ämnen och exakt replikatanalys11. Variationskoefficienter (CV) eller relativa standardavvikelser är cirka 10%, och FID-skannerns totala lipiddata är normalt cirka 90% av dem som erhålls med gravimetriska och andra metoder2. Gravimmetri ger högre totala lipider sannolikt eftersom FID-skannern endast mäter icke-flyktiga föreningar, och även som ett resultat av eventuell inkludering av icke-lipidmaterial i gravimetriska mätningar.
Informationen som tillhandahålls av lipidklassanalys är särskilt användbar i kombination med bestämningar av fettsyror som individer, eller steroler, eller de två i kombination. Det första steget mot dessa analyser är frisättning av alla komponentfettsyror tillsammans med steroler i lipidextrakten (protokollsteg 5). Det stora utbudet av lipidstrukturer och lipidfunktioner innebär att de har sett en bred användning i ekologiska och biogeokemiska studier som bedömer ekosystemens hälsa och i vilken utsträckning de har påverkats av antropogena och terrestra insatsvaror. De har använts för att mäta biosyntesen av ämnen av kostvärde till den marina faunan samt för att ange kvaliteten på vattenprover. Mätning av lipider i sedimentkärnprover hjälper till att visa sedimentens känslighet för förändringar i människans markanvändning nära land-havsmarginalen.
Det primära verktyget för att identifiera och kvantifiera enskilda lipidföreningar har traditionellt varit gaskromatografi (GC) med FID. Före analys görs dock dessa föreningar mer flyktiga genom härledning. Fettsyror frigörs i närvaro av en sur katalysator (H2SO4) från acylfettklasser (figur 1). I organisk kemi kommer akrylgruppen (R-C=O) vanligtvis från en karboxylsyra (R-COOH). De re-esterified sedan till fettsyra metylestrar (FAME) som ger bättre separationer på GC kolonner (protokoll steg 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den hastighet med vilken TLC-FID-systemet tillhandahåller information om synoptisk lipidklass från små prover gör TLC-FID till ett verktyg för screening av marina prover innan man genomför mer involverade analytiska förfaranden. Sådana analyser kräver vanligtvis frisättning av komponentföreningar från lipidextrakt och härledning för att öka volatiliteten vid gaskromatografi. TLC-FID i kombination med GC-FID har visat sig vara en kraftfull kombination för extrakt av skaldjur och andra livsmedel<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) anslagsnummer 105379 till C.C. Parrish. Memorial Universitys Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Network hjälpte till att finansiera denna publikation.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
