Denna artikel beskriver två metoder för hela kroppen kortvarig hypotermi induktion hos råttor. Den första snabba induktionsmetoden använder aktiv kylning med fläktar och etanolspray för en snabb temperatursänkning. Den andra metoden är en gradvis kylmetod. Detta uppnås med hjälp av kombinationen av isofluranbedövning och minskning av temperaturinställningarna på den hematermiska värmemattan. Detta resulterar i en gradvis minskning av kroppstemperaturen i kärnan utan användning av externa kylanordningar.
Terapeutisk hypotermi (TH) är en kraftfull neuroprotektiv strategi som har gett robusta bevis för neuroprotektion i prekliniska studier av neurologiska störningar. Trots starka prekliniska bevis har TH inte visat effekt i kliniska prövningar av de flesta neurologiska sjukdomar. De enda framgångsrika prövningarna med terapeutisk hypotermi var relaterade till hjärtstillestånd hos vuxna och hypoxisk skandinaviska skador hos nyfödda. Ytterligare undersökningar av parametrarna för dess användning och jämförelser av studiedesign mellan prekliniska och kliniska studier är motiverade. Denna artikel visar två metoder för kortvarig hypotermi induktion. Den första metoden möjliggör snabb hypotermiinduktion hos råttor med etanolspray och fläktar. Denna metod fungerar genom att kyla huden, som har använts mindre ofta i kliniska prövningar och kan ha olika fysiologiska effekter. Kylning är mycket snabbare med denna teknik än vad som är möjligt hos mänskliga patienter på grund av skillnader i yt-till-volymförhållande. Tillsammans med detta presenteras också en andra metod, vilket möjliggör en kliniskt uppnåelig kylhastighet för kortvarig hypotermi. Denna metod är lätt att implementera, reproducerbar och kräver inte aktiv hudkylning.
TH är praxis att kyla kropps- eller hjärntemperatur för att bevara livskraften och funktionen hos organet / systemet1,2. Hypotermiens roll i neuroprotection har undersökts och har visat fördelar i en rad prekliniska modeller av neurologiska sjukdomar som stroke3,subarachnoid blödning4, och traumatisk hjärnskada5. När det gäller kliniska tillämpningar har TH visat effekt hos patienter efter hjärtstillestånd och vid neonatal hypoxisk-ischemisk skada6.
TH-induktion uppnås med hjälp av antingen yt- eller endovaskulära kylmetoder. Majoriteten av prekliniska hypotermistudier utför ytkylning genom att applicera vatten eller etanol på djurets päls, eller genom att använda en kylfilt för att uppnå måltemperatur1. Hos människor uppnås systemisk ytkylning med hjälp av ispaket och kylfiltar7,8. Snabbare kylning har visats hos patienter som använder endovaskulära metoder, som parar en induktionsinfusion av kall saltlösning genom en intravenös eller intraartärkateter, med placering av en endovaskulär kylanordning i den sämre vena cava9,10. Till exempel kan en måttlig måltemperatur på 33 °C uppnås i 1,5 timmar med endovaskulär kylning jämfört med 3-4 h med ytkylning hos patienter11. Det endovaskulära tillvägagångssättet har också blivit mer populärt under de senaste åren eftersom det har rapporterats att minska några av de biverkningar som ses i systemisk ytkylning, såsom darrande12,13. Den europeiska multicenter, randomiserade kliniska fas III-studien av hypotermi för ischemisk stroke (EUROHYP-1) som främst används ytkylning14. Resultat som nyligen publicerats från denna studie visade att frossa var en stor komplikation och kan ha begränsat förmågan att uppnåmåltemperaturen 10. Det darrande svaret är känt för att främst drivas av hudtemperatur. Vissa ansträngningar har gjorts för att utveckla en gnagare endovaskulär kylmetod15, men den mycket invasiva karaktären av tekniken jämfört med den som används hos människor, riskerar att förvirra eventuella resultat som erhållits från den modellen.
Temperatur är den viktigaste modulatorn för biologiska processer i kroppen och regleras tätt av homeostas. Därför kan all manipulering av kroppstemperaturen ha associerade risker. Kylning varaktighet är en faktor som kan ha begränsat framgången för hypotermi kliniska prövningar. Dessa försök använder en långvarig kylmetod, med många upprätthålla hypotermi från 24-72 h11. Denna förlängda varaktighet utgör en risk för infektion under kylprotokollet. Lunginflammation är den vanligaste komplikationen från hypotermi, som drabbar mellan 40-50% av patienterna som genomgår proceduren13. Detta står i kontrast till vad som normalt ses i djurstudier av hypotermi där ett kortvarig paradigm används (1-6 h)3. Framgången för dessa prekliniska djurstudier kommer sannolikt att leda till anpassning av kortvarig hypotermi för användning i kliniska prövningar. Som ett resultat är det nödvändigt att ha en djurmodell av kortvarig hypotermi som liknar kylningsgraden för framtida kliniska prövningar. Ytterligare detaljer om andra temperaturparametrar och giltigheten av kortvarig hypotermi har diskuterats i flera granskningsartiklar1,16,17,18.
Demonstreras här är en gradvis modell av kylning som är mer kliniskt uppnåelig än nuvarande experimentella hypotermi modeller. Denna nya metod har en mycket långsammare kylhastighet och därför är tiden att rikta temperaturen närmare intervallet för dem som ses i kliniska prövningar av hypotermi11. Det undviker också direkt ytkylning, som har specifika fysiologiska effekter, och kan därför vara mer jämförbar med endovaskulär kylning, som har varit den vanligaste kylmetoden i kliniska prövningar9,12. Denna modell gör det möjligt att kyla djuren gradvis över 2 timmar följt av en kort period av underhåll vid måltemperatur. Dessutom demonstreras den snabba kylning kortvariga hypotermimetod 19 också. Snabbkylningsmetoden gör det möjligt att uppnå måltemperaturen snabbt efter hypotermi. Även om detta tillvägagångssätt inte är lika kliniskt relevant som den gradvisa kylningsmetoden, är det användbart för studier som syftar till att utforska mekanismerna för hypotermi neuroprotektion för att potentiellt efterlikna dess kraftfulla neuroprotektiva effekter farmakologiskt. Denna metod har också potentiella tillämpningar utanför neurovetenskap och kan anpassas till valfritt antal prekliniska studier. En annan fördel med båda metoderna jämfört med andra metoder är att de är billiga och inte kräver specialutrustning. Slutligen visar detta protokoll också implantation av temperaturdataloggers, eftersom postoperativ uppvärmning och övervakning av dessa är viktiga för att förhindra oavsiktlig postoperativ hypotermi, med dess potential att förvirra studieresultat20.
De procedurer som beskrivs här är lätt genomförda, icke-invasiva och ger tillförlitliga och reproducerbara minskningar av kroppstemperaturen till önskad måltemperatur.
Det finns flera kritiska steg i snabbkylningsmetoden som inkluderar följande. Övermätta inte etanolspray – var försiktig så att du inte blötlägger djuret i etanol, eftersom detta kommer att störa resultaten. Övervaka djuret under hypotermi induktion- försiktighet måste vidtas för att noggrant övervaka djurs svar på snabb hypotermi induktion. En noggrann bevakning av rektaltemperaturen är viktig för att säkerställa att temperaturen inte går under önskat mål – om detta händer, stäng av fläktarna och låt värmelampan försiktigt rewarm djuret tillbaka upp till önskat mål.
I båda metoderna är fysiologisk övervakning viktigt för att säkerställa lämplig justering av bedövningsdosen. För långvarig kylning kan otillräcklig bedövningsdos förlänga kyltiden. I detta fall kan isoflurankoncentrationen ökas tills en tillräcklig kylhastighet uppnås. Ett annat kritiskt steg är korskalibreringen av temperaturenheter. När du använder en temperatursondreglerad värmematta och en datalogger i samma experiment är det bästa praxis att korskalibrera dataloggern med rektalsonden in vivo, eftersom det kan finnas mindre variationer i den registrerade temperaturen på de två enheterna.
Dessa metoder är lämpliga för studier som vill utforska användningen av hypotermi som en potentiell behandling för neurologiska sjukdomar. Det specifika syftet med studien bör diktera vilken metod som används. Båda metoderna kan klassas som systemisk ytkylning, men den andra metoden kräver ingen aktiv kylning. Den gradvisa kylmodellen som beskrivs ovan har viktiga potentiella tillämpningar för användning av hypotermi vid behandling av ischemiska stroke. Långvarig hypotermi och deras resulterande komplikationer utgör en utmaning för äldre stroke patienter. Dessutom gör det darrande svaret det svårt att uppnå måltemperatur hos vissa patienter10. Medan anti-darrande medicinering kan bidra till att minska det darrande svaret, kan kortvarig gradvis kylning mer effektivt lindra problemet. Att ha en kortare kylperiod kommer sannolikt också att minska förekomsten av lunginflammation som ofta rapporteras i prövningar. En annan potentiell fördel med denna kortvariga metod är att omvärmningshastigheten kanske inte är lika viktig jämfört med långvarig kylning. Mycket tidiga kliniska studier av långvarig kylning hos strokepatienter med stora infarkter fann att snabb omvärmning ledde till stora höjder i intrakraniellt tryck (ICP), vilket försämrade resultatet och ofta var dödligt. Detta ledde till utvecklingen av gradvisa omvärmningsparadigmer, vilket ytterligare förlängde kylningens totala varaktighet. Kortvarig kylning bibehåller endast måltemperaturen under en kort period och kan mindre sannolikt resultera i rebound ICP. Tidigare arbete som har undersökt hypotermibehandling för ICP-höjd, med ett liknande snabbt kylnings- och omvärmningsprotokoll som de som beskrivs här, har inte visat någon rebound ICP-höjd efter omvarning23,24.
Kliniska prövningar av hypotermi för behandling med ischemisk stroke har inte kunnat översätta fördelarna med hypotermi som rapporteras i experimentella studier. Felmatchningen i kylningshastigheter och varaktighet mellan experimentella modeller och patienter är viktiga variabler som kan förklara denna diskrepans. Att ha en experimentell modell av hypotermi som bättre liknar den kliniska kylhastigheten kommer att möjliggöra en mer informerad undersökning av fördelarna med hypotermi som en behandlingsåtgärd för strokepatienter.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt finansierades av University of Newcastle, Hunter Medical Research Institute (HMRI) Dalara Early Research Career Researcher Fellowship, NSW Health Early-Mid Career Research Fellowship och National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia.
Absolute ethanol | ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem | AJA214-20LPL | Diluted with deionized water to give 70 % ethanol |
Antiseptic solution (Chlorhexidine) | David Craig | A2957 | |
Anaesthetic (Marcain) | Aspen | PS13977 | |
Brushless fan motor | Sirocco | YX2505 | 2 x 12 V/130 mA |
Heat lamp | Reptile One | AC220 | 240 V 50/60 Hz |
Heat pad | FHC, Inc | 40-90-2 | |
Rectal probe | FHC, Inc | 40-90-5D-02 | |
Temperature controller | FHC, Inc | 40-90-8D | |
Temperature Datalogger | Maxim | DS1922L-F5 |