Her demonstrerer vi en optimeret teknik til vurdering af sårreparation ved hjælp af ex vivo menneskelig hud kombineret med en helmonteret farvningsmetode. Denne metode giver en præklinisk platform til vurdering af potentielle sårbehandlinger.
Kroniske ikke-helbredende sår, som primært påvirker ældre og diabetikere, er et betydeligt område af klinisk uopfyldte behov. Desværre, nuværende kroniske sår behandlinger er utilstrækkelige, mens tilgængelige prækliniske modeller dårligt forudsige den kliniske effekt af nye behandlinger. Her beskriver vi en høj gennemløb, præklinisk model til at vurdere flere aspekter af den menneskelige hud reparation svar. Delvis tykkelse sår blev skabt i human ex vivo hud og dyrket på tværs af en helbredende tid kursus. Hud sår biopsier blev indsamlet i fiksativ for hele mount farvning procedure. Faste prøver blev blokeret og inkuberet i primært antistof, med detektion opnået via fluorescerende konjugeret sekundært antistof. Sår blev kontrastellet og afbildet via konfokal mikroskopi, før de beregnede procentvis sårlukning (re-epitelisering) i hver biopsi. Ved anvendelse af denne protokol afslører vi, at 2 mm ekscisionssår skabt i sund donorhud er fuldt epiteliseret af dag 4-5 post-sår. Tværtimod reduceres lukningsraten for diabetiske hudsår betydeligt, ledsaget af forstyrret barrierereformation. Ved at kombinere menneskelige hud sår med en ny hel-mount farvning tilgang giver en hurtig og reproducerbar metode til at kvantificere ex vivo sår reparation. Samlet set giver denne protokol en værdifuld menneskelig platform til at evaluere effektiviteten af potentielle sårbehandlinger, omdanne prækliniske test og validering.
Kroniske, ikke-helbredende sår, som er meget udbredt hos ældre og diabetikere, er et stort uanvendeligt område af klinisk uopfyldte behov. Disse sår udgør en stor fysisk og psykologisk byrde for patienterne og koster sundhedsudbydere milliarder hvert år at behandle1. På trods af forbedret forståelse af sårbiologi og fremskridt inden for teknologi, op til 40% af kroniske sår stadig ikke helbrede efter bedste standard pleje2. Således kræver 14-26% af patienter med diabetiske fodsår efterfølgende amputation3, mens den 5-årige post-amputationsdødelighed ligger på ca. 70%4. Som følge heraf er der et presserende behov for at udvikle effektive nye behandlingsformer for at forbedre patienternes livskvalitet og samtidig reducere den betydelige sundhedsbyrde, der pålægges af dårlige helbredende sår. Dårligt prækliniske modeller er fortsat en betydelig hindring for udviklingen af effektive nye behandlingsformer.
Sårreparation er en dynamisk og mangefacetteret proces, der involverer en bred vifte af celletyper, utallige niveauer af kommunikation og et vævsmiljø, der er temporalt ombygget. Hudheling understøttes af fire store reparative stadier: hemostase, inflammation, spredning og matrix remodeling. Disse stadier virker i sidste ende for at forhindre blodtab og infektion, lukker sårets overflade (en proces betegnelse re-epitelisering) og returnerer huden til en uskadt tilstand5. Kroniske sår er forbundet med forskellige ætiologi og udbredt forstyrrer til helbredende processer6, hvilket yderligere komplicerer identifikationen af terapeutiske mål. Ikke desto mindre er der udviklet en bred vifte af modeller til både at belyse de molekylære og cellulære drivkræfter bag sårpatologi og teste nye terapeutiske tilgange7.
Den mest anvendte sårreparationsmodel er akut sår i musen. Mus er meget tractable for mekanistiske undersøgelser og giver validerede modeller for aldring og diabetes8. På trods af de generelle ligheder, der er vist blandt mus og menneskelig helbredelse, er der stadig forskelle mellem arter i hudstruktur og helbredende dynamik. Det betyder, at de fleste murine sår forskning ikke let oversætte til klinikken9. Der har derfor været et fremstød i retning af menneskelige in vitro – og ex vivo-systemer med høj anvendelighed og omsættelighed10,11.
Her giver vi en dybdegående protokol for udførelse af delvis tykkelse excisional sår i ex vivo menneskelig hud. Vi skitserer også vores helmonterede farvningsmetode som en meget reproducerbar metode til evaluering af ex vivo menneskelig hudheling. Vi viser bane epidermal reparation (re-epitelialization) og efterfølgende barriere dannelse, evaluere hastigheden af sår lukning i sund versus diabetisk menneskelig hud. Endelig demonstrerer vi, hvordan helmonteringsbejdning kan tilpasses til brug med en række antistoffer for at vurdere forskellige aspekter af den helbredende reaktion.
I denne eksperimentelle protokol beskriver vi en optimeret metode til vurdering af sårlukning i human ex vivo-hud ved hjælp af helmontering af vævsbegævning. Dette er en vigtig ressource til at muliggøre kritisk vurdering af potentielle sårbehandlinger, og til at give en bedre forståelse af de menneskelige sår reparation svar. Vi har offentliggjort healing vurdering i ex vivo hud sår tidligere12,13, men i disse rapporter hele mount farvning tilgang blev ikke brugt til at måle sår lukning. Helmontering farvning er langt lettere og kræver mindre teknisk erfaring end standard histologi, som indebærer paraffin eller OCT indlejring og sektionsopderinger af prøver. Hele monteringsproceduren reducerer også eksperimentel variation, hvilket gør det muligt at kvantificere hele såret og ikke kun et enkelt tværgående afsnit på et bestemt sted i vævet (se figur 4B for sammenlignende illustration). Vi støtter fuldt ud vigtigheden af at kvantificere heling af hele den ikke-symmetriske sårstruktur, som klart skitseret af Rhea og Dunnwald for murine akutte sår14. Disse forfattere viste vigtigheden af serielt sektion i vivo excisional sår for reproducerbare og præcise målinger af sårmorfologi. Seriel sektionsopderinger kan også anvendes på humane ex vivo-sår; For nøjagtig kvantificering af sårlukning og re-epitelisering bør høj gennemløb af helmonteringsbejdning dog være den foretrukne metode. Vi bemærker, at denne helmonterede farvningsprotokol også bør være kompatibel med efterfølgende forarbejdning (voks eller OLT) til traditionel histologisk analyse.
Helmontering farvning er ikke uden ulemper. Selv om det giver højere reproducerbarhed i sårheling eksperimenter, det kræver brug af mere væv til analyse end standard histologiske teknikker. Dette kan være et problem, hvor vævsadgangen er begrænset, især hvor flere antistoffer skal vurderes. En alternativ fremgangsmåde ville være at anvende en indsnitssårmetode, hvor sårbredden er relativt ensartet, og variationen reduceres (som vist i mus og menneskelige sår15,16). Ekscisionale sår gælder dog stadig mere for de fleste patologiske sårtyper17.
I denne undersøgelse blev der skabt 2 mm sår med delvis tykkelse i midten af 6 mm hud explants. Denne metode kan optimeres til alternative excisional sår og explant størrelser på forskellige huddybder18. Derudover vil den kraft, der kræves for at generere sår variere mellem donorer, hvor alderen hud vil kræve mindre kraft til biopsi. Vi ville også undgå at bruge huden viser fremtrædende strækmærker eller andre strukturelle ændringer. Vi har valideret en række antistoffer til at overveje forskellige aspekter af ex vivo healing respons. Denne protokol kan også anvendes sammen med andre hudrelevante antistoffer, hvor antistofkoncentrationer og inkubationstider skal optimeres. Ikke desto mindre mener vi, at vores protokol er bedst egnet til absolut kvantificering af total sårlukning efterfulgt af rumlig vurdering af specifikke proteiner af interesse. Mens hele mount giver reduceret opløsning af immunolocalization versus standard histologiske analyse af væv sektioner, det giver yderligere 3D-oplysninger, der mangler fra standard 2D histologi.
En advarsel for at vurdere heling i ex vivo hud versus in vivo modeller er, at det mangler en systemisk reaktion. Et vigtigt aspekt af sårreparation er betændelse og efterfølgende vævsgranulering, som er forårsaget af en tilstrømning af inflammatoriske celler og endotelceller fra vaskulaturen19. På trods af denne begrænsning giver ex vivo-huden stadig en bedre rekapitulation af klinisk helbredelse end cellebaserede såranalyser. In vitro-eksperimenter involverer generelt monolag af enkeltcelletypen eller samkulturer, der dyrkes på vævskulturens plast, mens ex vivo-hud giver et indfødt miljø til at udforske celleadfærd. For nylig er der opstået en række hudækvivalentsystemer, hvor huden dyrkes i et laboratorium fra kunstig matrix og isolerede hudceller20,21. Selv om disse modeller efterligner menneskelig hud bedre end de fleste in vitro tilgange, de stadig ikke fuldt ud simulere det indfødte væv miljø og er generelt for skrøbelige til at skade reproducerbart. Derudover har vi (og andre) vist, at ex vivo humant hudvæv bevarer bosiddende immunceller, hvilket uden tvivl vil bidrage til reparation22,23. Det fremtidige arbejde bør nu fokusere på at udvide ex vivo-modellens levedygtighed og immunokompetence med henblik på senhelbredelsesvurdering 24. En mulighed er yderligere fremme af lovende organ-on-a-chip teknologier i stand til at forlænge væv levedygtighed og opretholde indfødte hud arkitektur i op til to uger i kultur25. Ex vivo-modeller er også begyndt at overveje vigtigheden af hudens inflammatoriske respons ved med succes at inkorporere immunceller, såsom neutrofiler, i værtsvævet26 eller injicere værtsvæv med antistoffer for at fremkalde en immunreaktion27. Vi forventer, at disse resultater vil bane vejen for udvikling af mere raffinerede og omsættelige metoder i fremtiden.
En væsentlig fordel ved at bruge ex vivo-hud til at måle sårlukning er evnen til at sammenligne helingsrater i sundt (f.eks. ikke-diabetisk) versus patologisk (f.eks. diabetiker eller alderen) væv. Her viste vi, at re-epitelisering og barriere dannelse er faktisk nedsat i diabetiker versus sunde ex vivo sår. Dette giver faktisk en vej til præklinisk vurdering af patologisk reparation, hvor aldring og diabetes er vigtige risikofaktorer for udvikling af kroniske sår1. Mens in vitro patologiske modeller findes, såsom celler isoleret fra alderen og diabetisk væv, eller celler dyrket i høj glukose til at efterligne hyperglykæmi28,29, disse celler kan hurtigt miste deres fænotype, når fjernet fra in vivo mikromiljø. En vigtig del af det ydre patologiske helbredende miljø er den dermale matrix, som ændres i både aldring og diabetes30. Faktisk påvirker denne forstyrrede matrix adfærden hos bosiddende og naive fibroblaster31,32. Således kan vigtigheden af at studere celler i deres værtsvævsmiljø ikke undervurderes.
Sammenfattende giver vores protokol en vigtig platform til at kvantificere human sår re-epitelisering, udforske regulatoriske faktorer og teste gyldigheden og effekten af potentielle terapier12,13. Selv om præklinisk testning stadig kræver in vivo-tilgange, bør en kombineret strategi, der anvender ex vivo humant væv og in vivo-skumle sår, forfine den prækliniske vej, hvilket reducerer brugen af dyr og samtidig øger overførbarheden på tværs af arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke hr. Paolo Matteuci og hr. George Smith for at have leveret patientvæv. Vi er også taknemmelige for Miss Amber Rose Stafford for at hjælpe med vævsindsamling og Daisy Appeal for at levere laboratoriefaciliteter.
50 mL Falcon Tubes | Falcon | 352070 | For skin washing |
1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) | Starlab | S1615-5510 | For whole-mount staining |
48-Well CytoOne Plate, TC-Treated | Starlab | CC7682-7548 | For whole-mount staining |
Acetic Acid Glacial | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | Part of fixative |
Alkyltrimethylammonium Bromide | Sigma-Aldrich | M7635 | Part of fixative |
Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] | Abcam | ab7817 | Stains blood vessels |
Anti-Collagen I Antibody | Abcam | ab34710 | Stains collagen |
Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] | Abcam | ab7800 | Stains epidermis |
CD1A Antibody (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | Stains Langerhans cells |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 62247 | Counterstain for cell nuclei |
Falcon 60mm Petri dishes | Falcon | 353004 | Human ex vivo culture |
Fibronectin Antibody (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | Stains fibronectin |
Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | Part of fixative |
Gauze Swabs | Medisave | CS1650 | To clean skin |
Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Human ex vivo culture |
Gibco DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | Human ex vivo culture |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Human ex vivo culture |
Gibco HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | Human ex vivo culture |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Human ex vivo culture |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | For immunoperoxidase staining |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | For image analysis |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | For viability assessment of tissue |
Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1×2 teeth | World Precision Instruments | 15917 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501264 | To create wounds |
Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501263 | To remove adipose tissue |
Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905201 | Stains epidermis |
Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905301 | Stains epidermis |
LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | Discontinued | For fluorescent imaging |
Merck Millipore Absorbent pads | Merck Millipore | AP10045S0 | Human ex vivo culture |
Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters | Merck Millipore | HNWP04700 | Human ex vivo culture |
Normal Goat Serum Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | Animal serum used depends on secondary antibody |
Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P3619 | For wash buffer |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | For blocking buffer |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | Part of fixative |
Sterilisation Pouches | Medisave | SH3710 | To sterilise instruments |
Stiefel 2mm biopsy punches | Medisave | BI0500 | For partial thickness wound |
Stiefel 6mm biopsy punches | Medisave | BI2000 | For outer explant |
Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | To prepare skin |
Triton X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | For wash buffer |
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody |
Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4800 | For immunoperoxidase staining |
Wireless Digital Microscope | Jiusion | N/A | For brightfield imaging |