CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類
Summary
このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26 遺伝子座に永久に統合されたEBFP2を発現する相同組換えドナープラスミドの2つのプラスミドが使用されます。
Abstract
免疫系の機能ゲノミクス研究は、標的遺伝子の欠失と目的のタンパク質への要素の追加の両方を含む遺伝子操作を必要とする。細胞系モデルにおける遺伝子機能の同定は、細胞固有のメカニズムの遺伝子発見と探索に重要である。しかし、特に静止状態では、これらの細胞のトランスフェクション効率が低いため、CRISPR/Cas9を介したノックインを用いたT細胞やマクロファージ細胞株などの免疫細胞の遺伝子操作は困難である。免疫細胞の遺伝子を改変するために、薬物耐性選択およびウイルスベクターは、通常、CRIPSR/Cas9系を発現する細胞を濃縮するために使用され、必然的に細胞の望ましくない介入をもたらす。以前の研究では、エレクトロポレーション後に一時的に発現したCRISPR/Cas9に結合した二重蛍光レポーターを設計しました。この技術的なソリューションは、免疫細胞の迅速な遺伝子欠失につながります;しかし、薬剤耐性選択やウイルスベクターを使用しないT細胞やマクロファージなどの免疫細胞における遺伝子ノックインはさらに困難です。本稿では、細胞選別を用いて、ドナープラスミドと組み合わせて Rosa26 遺伝子座を標的とするCRISPR/Cas9構築物を一時的に発現する細胞の選択を支援することで、薬剤耐性濃縮のないT細胞とマクロファージの両方で遺伝子ノックインを達成できることを示す。一例として、現在のCovid-19大流行を担うSARS-Cov-2の受容体であるヒトACE2を、ノックイン実験を行ってRAW264.7マクロファージで発現させる方法を示す。このような遺伝子ノックイン細胞は、幅広く、機械研究に使用することができる。
Introduction
免疫細胞は病原体に対する防御に不可欠です。感染者のクリアランスと組織恒常性の維持のためには、自然免疫と適応免疫の両方が必要です1,2.細胞株モデルは、哺乳類の免疫系の分子基礎を理解するための不可欠なツールです。それらは、ヒトT細胞活性化をモデル化するもののようなインビトロ機能アッセイにおいて用いられ、免疫応答を活性化または減衰させる遺伝的要因の機能を決定する際に3、4。哺乳類の免疫系は非常に異質であり、同様に重要な、膨大な数の分子が、所定の細胞型5、6の分化、移動、および機能を制御することに注意することが重要である。
クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas9ゲノム編集ツールは、特定の細胞タイプの遺伝子操作を可能にし、遺伝子の機能的注釈を正確な方法7,8に容易にする。いくつかの公表されたプロトコルは、HEK293細胞におけるリボヌクレオタンパク質(RnPs)として知られているCas9ガイドRNA複合体の形態でCRISPR/Cas9の送達を説明している、ジュルカット細胞株、原発性T細胞9、10、マクロファージ11、12、13、幹細胞14、および他の15、16。これらのプロトコルにおいて、遺伝子タグ付けは、通常、内因性タンパク質17,18に蛍光タグを融合させることによって達成される。しかし、単一細胞選別に対応する二重蛍光レポーターを用いて、特に免疫細胞におけるノックイン実験19,20を容易にする試みがなされている。
免疫細胞における新しい遺伝的因子の機能を理解することを目的とした詳細な機械分析は、一般的に遺伝子の細胞型特異的な欠失、遺伝子救助実験、および理想的には、そのインターアクターの同定を必要とする。免疫細胞の遺伝子の遺伝的欠失の最適化方法は9、15、21に公表されているが、免疫応答を理解するために多目的な機能を持つノックイン対立遺伝子を導入する方法ははるかに少ない報告を受けている。したがって、このプロトコルでは、ヒトおよびマウスの両方の免疫細胞株において、目的のタンパク質(POI)を安全な港のLocus Rosa26で発現させる効率的で再現性の高いプロトコルを詳細に記述することを目指しています。CRISPR/Cas9(DsRed2)を発現するプラスミドを導入した細胞に対して、細胞選別で分離できる組換えDNAテンプレート(EBFP2)を用いて濃縮する2色レポーターシステムを設計しました。このプロトコルに従って、我々は、研究が不十分なタンパク質の機能解析のためにヒトT細胞株JurkatとマウスマクロファージRAW264.7の複数のノックインラインを得た。
一例として、このプロトコルでは、ヒトACE2(SARS-Cov-2の受容体)を安定的に発現するマクロファージRAW264.7マクロファージを安定的に得る方法を本プロトコルで示す。自然免疫細胞は、Covid-1923、24およびヒトACE2の病因に関与しているため、複製前に細胞へのウイルス侵入に必要な主要な受容体とみなされるため、ヒトACE2のノックインを伴うマクロファージは、マクロファージ内のウイルス増殖の機械化研究に有用なツールとして役立つ。また、ヒトROSA26遺伝子のノックイン例を、アミノ末でアフィニティツインストレップタグ(OST)と融合したRASGRP1タンパク質を発現させる例も紹介しています。T細胞は免疫療法における主要な標的細胞であり、癌25,26に対する応答性の操作に焦点を当てた研究が増えている。Rasgrp1はT細胞受容体の下流にある重要なシグナル伝達分子であることが知られており、そのインターアクターは27を十分に解明されていないので、OST-RASGRP1ノックインモデルは、T細胞の腫瘍および感染に対する応答を調節する界発体を同定するための基盤を提供する。これらのツールを組み合わせることで、Covid-19の研究やRasgrp1と相互作用する新しい分子の発見に使用できます。
Protocol
1. Rosa26遺伝子座を標的としたsgRNAの設計とプラスミド構築 目的の挿入部位の周りの設計ガイドのRNA マウスRosa26の挿入部位 (以下、mRosa26と指定される) ノックイン実験がmRosa26の最初のイントロンに位置していることを確認します。このサイトは、以前の研究で使用されています28,29.?…
Representative Results
mRosa26遺伝子座でのノックイン実験を行うプロトコルに従って、マウスRAW264.7マクロファージを用いて、SARS-Cov-2ウイルスの受容体であるヒトACE2を発現させる標的ベクターを設計した(図2A)。同様の設計を用いて、OST タグ付き RASGRP1融合タンパク質のノックインを持つヒト Jurkat T 細胞を生成しました (図 2C)。3つのプラスミドのトランスフェク?…
Discussion
実験では、ヒトのJurkat T細胞とマウスRAW264.7マクロファージを例に、構築設計からノックイン細胞スクリーニング、検証まで、免疫細胞のノックイン編集を行う方法を実証しました。T細胞およびマクロファージ細胞株は両方トランスフェクション36、37に耐性である。しかし、CRISPR/Cas9送達の低効率の問題は、蛍光レポーターの助けを借りて細胞の選…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
新郷医科大学のフローサイトメトリーコア施設に感謝します。このような技術の開発は、LZ、81471595、および32070898に81601360のNSFC助成金によって支えられてきました。この作品は河南教育委員会第21IRTSTHN030の財団によっても支援されています。
Materials
| Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
| Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
| Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
| BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
| Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
| E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
| FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
| GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
| Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
| Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
| LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
| Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
| Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
| Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
| Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
| RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
| Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
| RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
| Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
| 1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
| 96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |
References
- Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
- Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
- Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
- Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
- Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
- Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
- Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
- Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
- Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
- Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
- Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
- Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
- Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
- Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
- Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
- Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
- Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
- Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
- Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
- Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
- Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
- Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
- Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
- Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
- Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
- Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
- Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
- Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
- He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
- Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
- Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
- Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
Cite This Article
Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).