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Abstract
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면역학 및 감염병학

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Published: November 13, 2021
doi:
10.3791/62328
, , , , , , , , ,
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Université

Summary

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

Abstract

면역 계통의 기능적인 유전체학 연구 결과는 표적 유전자의 삭제 및 관심있는 단백질에 요소의 추가를 둘 다 관련시키는 유전 조작을 요구합니다. 세포주 모형에 있는 유전자 기능의 확인은 세포 본질적인 기계장치의 유전자 발견 그리고 탐구를 위해 중요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9 매개 노크인을 사용하여 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 유전자 조작은 특히 정지 상태에서 이러한 세포의 낮은 경질 효율 때문에 어렵습니다. 면역 세포에서 유전자를 수정하기 위해 약물 내성 선택 및 바이러스 벡터는 전형적으로 CRIPSR/Cas9 시스템을 발현하는 세포를 보강하는 데 사용되며, 이는 필연적으로 세포의 바람직하지 않은 개입을 초래합니다. 이전 연구에서는 전기기화 후 일시적으로 표현된 CRISPR/Cas9에 결합된 이중 형광 기자를 설계했습니다. 이 기술적인 해결책은 면역 세포에 있는 급속한 유전자 삭제로 이끌어 냅니다; 그러나, 약물 내성 선택 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포에서 유전자 노크인은 더욱 도전적이다. 본 기사에서는, 당사는 세포 선별을 사용하여 기증자 플라스미드와 함께 Rosa26 궤적을 대상으로 CRISPR/Cas9 구조를 과도하게 표현하는 세포의 선택을 지원함으로써, 유전자 노크-인은 약물 저항 농축 없이 T 세포 및 대식세포 모두에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 우리는 인간 ACE2를 발현하는 방법을 보여줍니다, SARS-Cov-2의 수용체, 이는 현재 Covid-19 전염병에 대한 책임이, RAW264.7 대식세포에서 노크 -인 실험을 수행하여. 이러한 유전자 노크 세포는 기계학 연구에 널리 사용될 수 있다.

Introduction

면역 세포는 병원체에 대한 방어를 위해 중요합니다. 선천성 면역은 감염제의 통관 및 조직 항상성1,2의유지보수에필요합니다. 세포주 모형은 포유류 면역 계통의 분자 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다; 그(것)들은 인간 T 세포 활성화를 모델링하는 것과 같은 체외 기능적인 소사에서 이용되고, 면역 반응3,4를활성화하거나 감쇠에 있는 유전 요인의 기능을 결정하는 에서. 포유류 면역 계통은 엄청나게 이질적이며, 동등하게 중요한, 분자의 거대한 숫자는 주어진 세포유형의분화, 이동 및 기능을 제어한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다5,6.

클러스터링 정기적으로 간격짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/Cas9 게놈 편집 도구는 정확한 방식으로 유전자의 기능성 기여를 용이하게 특정 세포 유형의 유전자 조작을 허용7,8. 여러 개의 출판 된 프로토콜은 HEK293 세포에서 리보뉴클레오 단백질 (RNPs)으로 알려진 Cas9 가이드 RNA 복합체의 형태로 CRISPR / Cas9의 전달을 설명했습니다, Jurkat 세포주, 1차 T 세포9,10,대식세포11,12, 13,줄기 세포14,및 기타15,16. 이들 프로토콜에서, 유전자 태깅은 일반적으로 내인성단백질(17,18)에형광 태그를 융합시킴으로써 달성된다. 그러나 특히 면역 세포에서 노크 인 실험19,20을용이하게하기 위해 단일 세포 분류와 호환되는 이중 형광 기자를 사용하는 시도는 거의 이루어지지 않았습니다.

면역 세포에 있는 새로운 유전 인자의 기능을 이해하기 위한 심층 기계분석은 일반적으로 유전자의 세포 형 특정 삭제, 유전 구조 실험 및 그것의 상호 작용자의 이상적으로 확인을 요구합니다. 면역 세포에서 유전자의 유전 삭제를 최적화하는 방법이9,15,21에발표되었음에도 불구하고 면역 반응을 이해하기 위해 다재다능한 기능을 가진 노크 인 알레를 도입하는 방법은 훨씬 적습니다. 따라서, 이 프로토콜에서 우리는 인간과 뮤린 면역 세포주 모두에서 안전한 항구 궤엽로26에서 관심있는 단백질 (POI)을 표현하는 효율적이고 매우 재현 가능한 프로토콜을 자세히 설명하는 것을 목표로합니다. CRISPR/Cas9(DsRed2)를 발현하는 플라스미드와 세포 분류에 의해 격리될 수 있는 재조합 DNA 템플릿(EBFP2)을 발한 플라스미드로 감염된 세포를 보강하기 위해 2색 리포터 시스템을 설계했습니다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 제대로 연구된 단백질의 기능적 분석을 위해 인간 T 세포주 Jurkat 및 뮤린 대식세포 RAW264.7의 다중 노크-인 라인을 획득했습니다.

예를 들어, 우리는 인간 ACE2 (SARS-Cov-2의 수용체)22를안정적으로 표현하는 노크인 RAW264.7 대식세포를 얻는 방법을 이 프로토콜에서 보여준다. 선천성 면역 세포는 Covid-1923,24 및 인간 ACE2의 병인에 관여하기 때문에 복제 전에 세포로 바이러스 성 진입에 필요한 주요 수용체로 간주되기 때문에, 인간 ACE2의 노크와 대식세포는 대식세포 내부의 바이러스 증식 연구의 기계형 연구를위한 유용한 도구로 사용될 수 있습니다. 병행하여, 우리는 또한 친화성 트윈 스트렙 태그 (OST)와 그것의 아미노산 종결에서 융합된 RASGRP1 단백질을 표현하기 위하여 인간 ROSA26 메뚜기에서 유전자의 노크인의 예를 제시합니다. T 세포는 면역 요법에서 주요 표적 세포이며, 연구의 증가는 암에 그들의 반응성의 조작에 초점을맞추고있다 25,26. Rasgrp1은 T 세포 수용체의 주요 신호 분자 하류로 알려져 있으며 그 인터액터는 잘 해명되지 않는27,OST-RASGRP1 노크 -인 모델은 종양 및 감염에 T 세포의 반응을 조절하는 상호 작용을 식별하기위한 기초를 제공합니다. 종합하면, 이 공구는 Covid-19 연구 및 Rasgrp1와 상호 작용하는 새로운 분자의 발견에 이용될 수 있습니다.

Protocol

1. 로사26 로커스를 대상으로 sgRNAs의 설계 및 플라스미드 건설 원하는 삽입 부위 주변의 설계 가이드 RNA 마우스 Rosa26(이하 mRosa26로 지정) 노크-인 실험에 대한 삽입 부위가 mRosa26의첫 번째 인트론에 위치하고 있는지 확인; 이 사이트는 이전 연구에서 사용 되었습니다28,29. 인간 세포에서?…

Representative Results

murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 mRosa26 궤적에서 노크-인 실험을 수행하기 위해 전술한 프로토콜에 따라, SARS-Cov-2바이러스(도 2A)의수용체인 인간 ACE2를 발현하기 위한 표적 벡터를 설계하였다. 유사한 설계를 사용하여, 우리는 OST 태그 RASGRP1 융합 단백질(도 2C)의노크인인간 Jurkat T 세포를 생성했다. 3개의 플라스미드의 전환 후, 그 중 2개는 CRISPR/…

Discussion

우리의 실험에서, 우리는 예를 예로 인간 Jurkat T 세포 및 murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 노크세포 검열 및 검증에 구조 설계에서 면역 세포에서 노크에 편집을 수행하는 방법을 보여주었습니다. T 세포및 대식세포주 모두 형질36,37에내성이 있다; 그러나 CRISPR/Cas9 전달의 저효율 문제는 세포 분류와 결합된 형광 기자의 도움으로 극복할 수 있다. 이 프?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

신샹의과대학의 유동 세포측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이러한 기술의 개발은 NSFC가 LZ, 81471595 및 YL에 32070898 81601360 보조금에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 허난교육위원회 제21IRTSTHN030재단의 지원도 받고 있다.

Materials

Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799
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References

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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).
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