Denne protokollen beskriver metodikken for ikke-invasiv sporing av T-celler genetisk konstruert for å uttrykke chimeriske antigenreseptorer in vivo med en klinisk tilgjengelig plattform.
T-celler genetisk utviklet for å uttrykke chimeric antigen reseptorer (CAR) har vist enestående resultater i pivotale kliniske studier for pasienter med B celle maligniteter eller flere myeloma (MM). Imidlertid begrenser mange hindringer effekten og forbyr utbredt bruk av CAR T-cellebehandlinger på grunn av dårlig menneskehandel og infiltrasjon på tumorsteder, samt mangel på utholdenhet in vivo. Videre er livstruende toksisiteter, som cytokinfrigjøringssyndrom eller nevrotoksisitet, store bekymringer. Effektiv og sensitiv bildebehandling og sporing av CAR T-celler muliggjør evaluering av T-cellehandel, ekspansjon og in vivo-karakterisering og gjør det mulig å utvikle strategier for å overvinne de nåværende begrensningene ved CAR T-celleterapi. Dette dokumentet beskriver metodikken for å inkorporere natriumjodidsymporteren (NIS) i CAR T-celler og for CAR T-celleavbildning ved hjelp av [18F]tetrafluoroborate-positron utslipp tomografi ([18F]TFB-PET) i prekliniske modeller. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes på andre CAR-konstruksjoner og målgener i tillegg til de som brukes til denne studien.
Chimeric antigen reseptor T (CAR T) celleterapi er en raskt fremvoksende og potensielt kurativ tilnærming i hematologiske maligniteter1,2,3,4,5,6. Ekstraordinære kliniske utfall ble rapportert etter CD19-rettet CAR T (CART19) eller B celle modning antigen (BCMA) CAR T celleterapi2. Dette førte til at US Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av CART19-celler for aggressiv B-celle lymfom (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 og lisocabtagene maraleucel)7, akutt lymfoblastisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellelymfom (breksucabtagen autoleuce)9, og follikulært lymfom (Axi-Cel)10 . Nylig godkjente FDA BCMA-rettet CAR T-cellebehandling hos pasienter med myelomatose (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Videre er CAR T celleterapi for kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) i sen klinisk utvikling og forventes å motta FDA-godkjenning i løpet av de neste tre årene1.
Til tross for de enestående resultatene av CAR T celleterapi, er den utbredte bruken begrenset av 1) utilstrekkelig in vivo CAR T celleutvidelse eller dårlig menneskehandel til tumorsteder, noe som fører til lavere rater av holdbar respons12,13 og 2) utviklingen av livstruende bivirkninger, inkludert cytokinfrigjøringssyndrom (CRS) 14,15 . Kjennetegnene til CRS inkluderer ikke bare immunaktivering som resulterer i forhøyede nivåer av inflammatoriske cytokiner / kjemokiner, men også massiv T-celleproliferasjon etter CAR T-celleinfusjon15,16. Dermed vil utviklingen av en validert, klinisk strategi for å bilde CAR T-celler in vivo tillate 1) CAR T cellesporing i sanntid in vivo for å overvåke deres menneskehandel til tumorsteder og avdekke potensielle motstandsmekanismer, og 2) overvåking av CAR T celleutvidelse og potensielt forutsi deres toksisiteter som utvikling av CRS.
Kliniske egenskaper ved mild CRS er høy feber, tretthet, hodepine,, diaré, artralgi, myalgi og ubehag. Ved mer alvorlig CRS kan pasienter utvikle takykardi/hypotensjon, kapillærlekkasje, hjertedysfunksjon, nyre-/leversvikt og spre intravaskulær koagulasjon17,18. Generelt har graden av forhøyelse av cytokiner, inkludert interferon-gamma, granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor, interleukin (IL)-10 og IL-6 vist seg å korrelere med alvorlighetsgraden av kliniske symptomer17,19. Imidlertid er den omfattende anvendelsen av “sanntids” serumcytokinovervåking for å forutsi CRS vanskelig på grunn av høye kostnader og begrenset tilgjengelighet. For å utnytte de fordelaktige egenskapene ved CAR T-celleterapi, kan ikke-invasiv avbildning av adoptiv T-celler potensielt brukes til å forutsi effekt, toksisiteter og tilbakefall etter CAR T-celleinfusjon.
Flere forskere har utviklet strategier for å bruke radionuklidbasert avbildning med positronutslippstomografi (PET) eller enkeltfotoutslippsberegnet tomografi (SPECT), som gir høy oppløsning og høy følsomhet20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 for in vivo visualisering og overvåking av CAR T cellehandel. Blant de radionuklidbaserte bildestrategiene er natriumjodidsympporteren (NIS) utviklet som en sensitiv modalitet for bildeceller og virus ved hjelp av PET-skanninger31,32. NIS+CAR T celleavbildning med [18F]TFB-PET er en sensitiv, effektiv og praktisk teknologi for å vurdere og diagnostisere CAR T-celleutvidelse, menneskehandel og toksisitet30. Denne protokollen beskriver 1) utviklingen av NIS+CAR T-celler gjennom dobbel transduksjon med høy effekt og 2) en metodikk for avbildning av NIS+CAR T-celler med [18F]TFB-PET-skanning. BCMA-CAR T-celler for MM brukes som konseptgodkjenningsmodell for å beskrive NIS som reporter for CAR T-celleavbildning. Imidlertid kan disse metodene brukes på enhver annen CAR T-celleterapi.
Dette dokumentet beskriver en metodikk for å inkorporere NIS i CAR T-celler og avbildning infundert CAR T celler in vivo gjennom [18F]TFB-PET. Som konseptbevis ble NIS+BCMA-CAR T-celler generert via dobbel transduksjon. Vi har nylig rapportert at inkorporering av NIS i CAR T-celler ikke svekker CAR T-cellefunksjoner og effekt in vivo og tillater CAR T cellehandel og utvidelse30. Ettersom CAR T-celleterapier fortsetter å ekspandere utover dagens B-celle mal…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet gjennom Mayo Clinic K2R-rørledningen (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) og Predolin Foundation (RS). Figur 1, 2 og 4 ble opprettet med BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |