यहां, हम परिधीय रक्त प्राकृतिक हत्यारा (पीबीएनके), यकृत ऊतकों से एनके कोशिकाओं और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) या कॉर्ड ब्लड (सीबी) से प्राप्त चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल विस्तारित एनके कोशिकाओं की अनुकूलित शुद्धता के अलावा 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके एनके और सीएआर-एनके कोशिकाओं के विस्तार को दर्शाता है।
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -संशोधित प्रतिरक्षा कोशिका चिकित्सा कैंसर और संक्रामक रोगों के लिए एक उभरता हुआ उपचार बन गया है। एनके-आधारित इम्यूनोथेरेपी, विशेष रूप से सीएआर-एनके सेल, गंभीर जीवन-धमकी विषाक्तता के बिना सबसे आशाजनक ‘ऑफ-द-शेल्फ’ विकास में से एक है। हालांकि, एक सफल सीएआर-एनके थेरेपी विकसित करने के लिए अड़चन एक तीसरे पक्ष से गैर-संपूर्ण, दीर्घकालिक, ‘ऑफ-द-शेल्फ’ सीएआर-एनके कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त कर रही है। यहां, हमने एपस्टीन-बार वायरस- (ईबीवी) ट्रांसफॉर्म्ड बी सेल लाइन का उपयोग करके एक नई सीएआर-एनके विस्तार विधि विकसित की, जो इंटरल्यूकिन -21 (आईएल -21) के आनुवंशिक रूप से संशोधित झिल्ली रूप को व्यक्त करती है। इस प्रोटोकॉल में, कॉर्ड रक्त और परिधीय रक्त, साथ ही ठोस अंग ऊतकों से एनके और सीएआर-एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं। यह काम सीएआर-एनके इम्यूनोथेरेपी के नैदानिक विकास को काफी बढ़ाएगा।
प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं लिम्फोसाइटों का एक महत्वपूर्ण उप-समूह हैं जो सीडी 56 को व्यक्त करती हैं और टी सेल मार्कर, सीडी 3 1,2 की अभिव्यक्ति की कमी होती है। पारंपरिक एनके कोशिकाओं को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है जो वायरल संक्रमित कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के इम्यूनोसर्विलांस के लिए जिम्मेदार होते हैं। टी कोशिकाओं के विपरीत, एनके कोशिकाएं सीडी 16 या अन्य सक्रिय रिसेप्टर्स का उपयोग करके संक्रमित या घातक कोशिकाओं को पहचानती हैं और एंटीजन पेप्टाइड्स और प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) वर्ग 1 अणु 3,4 के बीच एक परिसर के गठन की आवश्यकता नहीं होती है। रिलैप्स या दुर्दम्य सीडी 19 पॉजिटिव कैंसर (गैर-हॉजकिन लिंफोमा या क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया [सीएलएल]) के इलाज के लिए चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-एनके कोशिकाओं का उपयोग करके हालिया नैदानिक जांच ने सीएआर-एनके कोशिकाओं के उत्कृष्ट सुरक्षा लाभ दिखाए। उदाहरण के लिए, सीएआर-एनके सेल इन्फ्यूजन न्यूनतम या नगण्य ग्राफ्ट बनाम होस्ट रोग (जीवीएचडी), न्यूरोटॉक्सिसिटी, कार्डियोटॉक्सिसिटी और साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) 6,7,8,9,10 से जुड़ा हुआ है। हालांकि, मानव एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के पारंपरिक तरीकों ने मजबूत भ्रातृहत्या और टेलोमेयर की कमी के साथ संपूर्ण फेनोटाइप दिखाए, जो दत्तक इम्यूनोथेरेपी11 के लिए पर्याप्त संख्या में कार्यात्मक एनके कोशिकाओं को प्राप्त करने में एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करता है।
इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, एक विकिरणित और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर 721.221 (इसके बाद, 221) सेल लाइन, एमएचसी वर्ग1 अणुओं की कम अभिव्यक्ति के साथ एक मानव बी-लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइन का उपयोग करके प्राथमिक एनके कोशिकाओं को सीधे परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) या कॉर्ड ब्लड (सीबी) से विस्तारित करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। पिछले अध्ययनों ने एनके सेल विस्तार में आईएल -21 के महत्व को दिखाया; इसलिए, 721.221 सेल लाइन (अब से, 221-एमआईएल -21 से शुरू) के एक संस्करण को व्यक्त करने वाला आनुवंशिक रूप से इंजीनियर झिल्ली-बाध्य आईएल -2111,12,13,14,15 विकसित किया गया था। परिणामों से पता चला है कि 221-एमआईएल -21 फीडर-सेल-विस्तारित प्राथमिक एनके कोशिकाओं को लगभग 2-3 सप्ताह तक लगातार उच्च एनके सेल शुद्धता के साथ औसतन >40,000 गुना तक विस्तारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के आवेदन के बारे में अतिरिक्त जानकारी यांग एट अल .16 में पाई जा सकती है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य पीबीएनके, सीबीएनके, ऊतक-व्युत्पन्न एनके और सीएआर-एनके कोशिकाओं के नए विस्तार की चरण-दर-चरण प्रक्रिया को प्रदर्शित करना है।
नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान सीएआर-एनके उत्पादों में से अधिकांश एनके सेल लाइन17 का उपयोग करते हैं, जैसे एनके -92, गैर-हॉजकिन के लिम्फोमा रोगी18 से अलग एक सेल लाइन, एनके -92एमआई, आईएल -2 स्वतंत्र एनके –92 सेल लाइन 19, और एनकेएल, एक बड़े दानेदार लिम्फोसाइट रोगी20 से अलग, क्योंकि ये सेल लाइनें आसानी से ‘ऑफ-द-शेल्फ’ उत्पादों के लिए प्रोलिफेरेटिव हैं। हालांकि, इन सेल लाइनों, जैसे, एनके -92 कोशिकाओं में मामूली नैदानिक प्रभाव और विवो विस्तार होता है, क्योंकि उन्हें जलसेक से पहले विकिरण की आवश्यकता होती है, इस प्रकार विवो21 में उनके प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी को सीमित किया जाता है। इन कारणों को देखते हुए, वर्तमान में परिधीय रक्त, सीबी, अस्थि मज्जा (बीएम), मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचएससी), प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी), और ट्यूमरऊतक21,22,23 सहित कई स्रोतों से प्राथमिक एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का पता लगाया जा रहा है। उदाहरण के लिए, एनके कोशिकाओं को आईएल -15, आईएल -18 और आईएल -21 सहित इंटरल्यूकिन का उपयोग करके विवो में विस्तारित किया जा सकता है। लिम्फोब्लास्टॉइड सेल लाइनें जैसे कि के 562 कोशिकाएं या एपस्टीन-बार वायरस-रूपांतरित लिम्फोब्लास्टोइड सेल लाइनें जैसे कि 721.221 कोशिकाएं, एनके सेल विस्तार16 के लिए भी उपयोग की जाती हैं। हालांकि, उपरोक्त रणनीतियां अक्सर सीएआर-एनके इम्यूनोथेरेपी22,24 के दत्तक हस्तांतरण के लिए एनके कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या उत्पन्न करती हैं। समस्या को हल करने में मदद करने के लिए, यहां अध्ययन आनुवंशिक रूप से संशोधित ईबीवी-रूपांतरित सेल लाइन, 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके एक पूर्व विवो एनके सेल विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है।
इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए 221-एमआईएल -21 फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके विस्तार पद्धति को अन्य ल्यूकेमिया सेल लाइनों की तुलना में कम से कम 10 से 100 गुना अधिक विस्तार दर के साथ एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें एचएल -60 और ओसीएल-एएमएल 3 झिल्ली आईएल -21, के 562 और के 652-एमआईएल 21 को व्यक्त करते हुए ओएक्स 40 लिगैंड 22,24,25 व्यक्त करते हैं। सीएआर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन लगभग 2 सप्ताह के लिए भी किया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रारंभिक एनके संवर्धन चरण के बिना, 221-एमआईएल -21 फीडर सेल विस्तार रणनीति को विभिन्न स्रोतों से एनके कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें पीबीएमसी, सीबी और यकृत जैसे ठोस अंग शामिल हैं। यद्यपि 221-एमआईएल -21 फीडर सिस्टम उपरोक्त फीडर सेल लाइनों के रूप में दाता-निर्भर नहीं है, यह दाताओं से पूरी तरह से स्वतंत्र नहीं है। औसतन, 221-एमआईएल -21 विस्तार प्रणाली उच्च एनके सेल संख्या के साथ एनके सेल शुद्धता का 90% प्राप्त कर सकती है, जिसमें विस्तार के बाद 14 वें दिन लगभग <5% टी सेल संदूषण होता है। इसलिए, टी सेल संदूषण की संभावनाओं को खत्म करने के लिए, एक्स विवो विस्तार से पहले प्राप्त नमूनों से एनके कोशिकाओं को अलग करना या एक्स विवो विस्तार के बाद टी कोशिकाओं को खत्म करने के लिए सीडी 3 + चयन प्रणाली का उपयोग करना आवश्यक है।
एनके सेल विस्तार प्रणाली का उपयोग करने में आलोचनाओं में से एक यह है कि फीडर कोशिकाओं को विस्तार के बाद या आधान से पहले पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है, जिसमें महत्वपूर्ण नियामक चिंताएं हो सकती हैं; इसलिए, आधान से पहले फीडर कोशिकाओं का पूर्ण उन्मूलन महत्वपूर्ण है। हालांकि, हाल ही में सीएआर-एनके नैदानिक परीक्षण जिसमें के562-एमआईएल 21-4-1 बीबीएल फीडर कोशिकाओं का उपयोग एक्स विवो सीबीएनके सेल विस्तार24,25 के लिए किया गया था, ने कोई संबंधित जटिलता नहीं दिखाई। इसके अलावा, हमारे प्रारंभिक आंकड़ों ने विस्तार की प्रगति के रूप में विकिरणित 221-एमआईएल -21 आबादी की क्रमिक कमी दिखाई (डेटा नहीं दिखाया गया)। हालांकि, नैदानिक सेटिंग में इस विस्तार पद्धति को लागू करने के लिए अधिक व्यापक अध्ययन की आवश्यकता है। सामूहिक रूप से, 221-एमआईएल -21 विस्तार प्रणाली प्राथमिक सीएआर-एनके कोशिकाओं के विस्तार की चुनौती को हल करने में मदद करती है, और इसलिए निकट भविष्य में सीएआर-एनके सेल-आधारित इम्यूनोथेरेपी के व्यापक उपयोग में महत्वपूर्ण योगदान देगी।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपियों पर उनकी टिप्पणियों के लिए लियू प्रयोगशाला के सदस्यों (डॉ सियांग-ची त्सेंग, डॉ शुएनिंग वांग और डॉ चिह-सिउंग चेन) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम एसएफजी वैक्टर के लिए डॉ जियानपिएट्रो डोट्टी और 721.221 कोशिकाओं के लिए डॉ एरिक लॉन्ग को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu), और रटगर्स-हेल्थ एडवांस फंडिंग (NIH REACH प्रोग्राम), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti, and R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) और रटगर्स यूनिवर्सिटी-न्यू स्कूल के लिए फंडिंग से समर्थित किया गया था।
100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS – w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |