प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा क्षणिक पिकोन्यूटन रिसेप्टर बलों को मैप करने के लिए डीएनए तनाव जांच
Summary
यह पेपर प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा लागू रिसेप्टर बलों की छवि के लिए डीएनए-आधारित तनाव जांच का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण वास्तविक समय में रिसेप्टर बलों >4.7pN को मैप कर सकता है और समय के साथ बलों को एकीकृत कर सकता है।
Abstract
दो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच जंक्शन पर और कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स के बीच जंक्शन पर प्रेषित यांत्रिक बल विकास से लेकर इम्यूनोलॉजी तक कई प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, आणविक पैमाने पर इन बलों का अध्ययन करने के लिए उपकरण विकसित करना महत्वपूर्ण है। हमारे समूह ने कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बलों को मापने और कल्पना करने के लिए आणविक तनाव सेंसर का एक सूट विकसित किया और विशिष्ट लिगेंड को प्रेषित किया। आणविक तनाव सेंसर के सबसे संवेदनशील वर्ग में न्यूक्लिक एसिड स्टेम-लूप हेयरपिन शामिल हैं। ये सेंसर यांत्रिक विस्तार और बल के तहत डीएनए हेयरपिन के प्रकटीकरण पर रिपोर्ट करने के लिए फ्लोरोफोरे-बुझाने वाले जोड़े का उपयोग करते हैं। डीएनए हेयरपिन तनाव सेंसर के साथ एक चुनौती यह है कि वे तनाव की समाप्ति पर तेजी से हेयरपिन के साथ प्रतिवर्ती होते हैं और इस प्रकार क्षणिक बलों को रिकॉर्ड करना मुश्किल होता है। इस लेख में, हम डीएनए तनाव सेंसर तैयार करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिन्हें यांत्रिक जानकारी के “भंडारण” को सक्षम करने के लिए “लॉक” किया जा सकता है और फिर से मोड़ने से रोका जा सकता है। यह अत्यधिक क्षणिक पिकोनवटन बलों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, जिसे बाद में पूरक न्यूक्लिक एसिड के अतिरिक्त “मिटा” किया जा सकता है जो लॉक को हटाते हैं। वास्तविक समय के तनाव मानचित्रण और यांत्रिक सूचना भंडारण के बीच टॉगल करने की यह क्षमता कमजोर, अल्पकालिक और कम प्रचुर मात्रा में बलों को प्रकट करती है, जो आमतौर पर टी कोशिकाओं द्वारा उनके प्रतिरक्षा कार्यों के हिस्से के रूप में नियोजित होती हैं।
Introduction
प्रतिरक्षा कोशिकाएं एंटीजन के लिए लक्षित कोशिकाओं की सतहों को लगातार रेंगने और स्कैन करके रोगजनकों और कैंसर कोशिकाओं से बचाव करती हैं, उनकी सतह 1,2 का अध्ययन करती हैं। एंटीजन पहचान टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) और पेप्टाइड-प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स एमएचसी (पीएमएचसी) कॉम्प्लेक्स के बीच बंधन पर शुरू की जाती है जो लक्ष्य कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की जाती है। क्योंकि टीसीआर-पीएमएचसी मान्यता दो मोबाइल कोशिकाओं के बीच जंक्शन पर होती है, यह लंबे समय से यांत्रिक बलों का अनुभव करने का संदेह है। इसके अलावा, इसने टीसीआर सक्रियण के मेकेनोसेंसर मॉडल को जन्म दिया, जो बताता है कि टीसीआर बल इसके कार्य 3,4 में योगदान करते हैं। यह समझने के लिए कि कब, कहां और कैसे यांत्रिक बल टी सेल फ़ंक्शन में योगदान करते हैं, टी कोशिकाओं द्वारा प्रेषित आणविक बलों की कल्पना करने के लिए उपकरण विकसित करना अनिवार्य है। परंपरागत रूप से, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) और माइक्रोपिलर सरणियों जैसे तरीकों का उपयोग सेलुलर बलों 5,6 की जांच के लिए किया जाता है। हालांकि, टीएफएम और माइक्रोपिलर सरणियों की बल संवेदनशीलता नैनोन्यूटन (एनएन) पैमाने पर है और इस प्रकार सेल रिसेप्टर्स7 द्वारा प्रेषित आणविक पिकोनेवटन (पीएन) बलों का अध्ययन करने के लिए अक्सर अपर्याप्त होती है। पता लगाने के लिए बल और स्थानिक संकल्प में सुधार करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने आणविक तनाव जांच के विकास का बीड़ा उठाया, जिसे शुरू में पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) पॉलिमर7 का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। आणविक तनाव जांच में एक विस्तारयोग्य आणविक “स्प्रिंग” (पीईजी, प्रोटीन, डीएनए) शामिल होता है जो फ्लोरोफोरे और बुझाने वाले से घिरा होता है और एक सतह पर लंगर डालता है। जांच के टर्मिनस पर लागू बल इसके विस्तार की ओर ले जाते हैं, फ्लोरोफोरे और बुझाने वाले को अलग करते हैं, और इस प्रकार एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न करते हैं (चित्रा 1 ए) 8,9,10।
पिछले एक दशक में हमने न्यूक्लिक एसिड11, प्रोटीन10 और पॉलिमर8 से बने वसंत तत्वों के साथ आणविक तनाव जांच के विभिन्न वर्गों की एक लाइब्रेरी विकसित की है। इनमें से, डीएनए-आधारित तनाव जांच शोर अनुपात और सबसे बड़ी बल संवेदनशीलता के लिए उच्चतम संकेत प्रदान करती है, जो आसानी से कुछ pN से ~ 20 pN11 तक ट्यून की जाती है। हमने फाइब्रोब्लास्ट, कैंसर कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं11,12,13 सहित कई विविध सेल प्रकारों द्वारा उत्पन्न आणविक बलों का अध्ययन करने के लिए इन वास्तविक समय डीएनए तनाव जांच का उपयोग किया है। यह पांडुलिपि पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पीएन बल रिज़ॉल्यूशन के साथ आणविक रिसेप्टर बलों को मैप करने के लिए सतह पर डीएनए तनाव जांच को संश्लेषित और इकट्ठा करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करेगी। जबकि वर्तमान प्रक्रिया में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (चित्रा 1 बी) को पेश करने के लिए न्यूक्लिक एसिड में रासायनिक संशोधन शामिल हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कई संशोधन और शुद्धिकरण चरणों को कस्टम डीएनए संश्लेषण कंपनियों को आउटसोर्स किया जा सकता है। इसलिए, डीएनए तनाव जांच तकनीक सरल है, और व्यापक सेल जीव विज्ञान और मेकेनोबायोलॉजी समुदायों के लिए सुलभ है।
संक्षेप में, डीएनए तनाव सेंसर को इकट्ठा करने के लिए, एक डीएनए हेयरपिन को एक हाथ पर फ्लोरोसेंट लिगैंड स्ट्रैंड और दूसरी बांह पर एक बुझाने वाले लंगर स्ट्रैंड में संकरित किया जाता है और फिर ग्लास सब्सट्रेट (चित्रा 1 सी, वास्तविक समय तनाव) पर स्थिर किया जाता है। यांत्रिक बल की अनुपस्थिति में, हेयरपिन बंद हो जाता है, और इस प्रकार प्रतिदीप्ति बुझ जाती है। हालांकि, जब लागू यांत्रिक बल एफ1/2 (संतुलन पर बल जो प्रकट होने की 50% संभावना की ओर जाता है) से अधिक होता है, तो हेयरपिन यांत्रिक रूप से पिघल जाता है, और एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न होता है।
वास्तविक समय डीएनए तनाव सेंसर पर निर्माण, हम संचित बलों को मैप करने के लिए प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके प्राकृतिक लिगैंड पर रिसेप्टर्स के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। ऐसा इसलिए है क्योंकि प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स अक्सर अल्पकालिक बंधन 3,14 प्रदर्शित करते हैं। संचित बलों को “लॉकिंग” स्ट्रैंड का उपयोग करके चित्रित किया जाता है जो अधिमानतः डीएनए हेयरपिन को खोलता है और यांत्रिक खींचने की घटनाओं (चित्रा 1 सी, लॉक तनाव) से जुड़े प्रतिदीप्ति संकेतों के भंडारण की अनुमति देता है। लॉकिंग स्ट्रैंड को एक क्रिप्टिक बाइंडिंग साइट को बांधने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो हेयरपिन के यांत्रिक रूप से प्रेरित पिघलने पर उजागर होता है और हेयरपिन को रिफोल्डिंग को अवरुद्ध करके खुली अवस्था में हेयरपिन को लॉक करता है, इस प्रकार तनाव संकेत को संग्रहीत करता है, और एक संचित तनाव मानचित्र उत्पन्न करता है। इसके अलावा, लॉकिंग स्ट्रैंड को आठ-न्यूक्लियोटाइड टोहोल्ड के साथ डिज़ाइन किया गया है, जो अपने पूर्ण पूरक, “अनलॉकिंग” स्ट्रैंड के साथ एक टोहोल्ड-मध्यस्थता स्ट्रैंड विस्थापन प्रतिक्रिया को सक्षम बनाता है। अनलॉकिंग स्ट्रैंड के अलावा, बाउंड लॉकिंग स्ट्रैंड को हेयरपिन निर्माण से हटा दिया जाता है, संग्रहीत तनाव संकेत को मिटा दिया जाता है और हेयरपिन को वास्तविक समय की स्थिति में वापस रीसेट किया जाता है।
चित्रा 1: अत्याधुनिक आणविक तनाव जांच की योजना । (ए) वास्तविक समय आणविक तनाव जांच का सामान्य डिजाइन, (बी) डीएनए-आधारित तनाव जांच निर्माण के लिए किस्में, और (सी) डीएनए-आधारित तनाव जांच और वास्तविक समय की स्थिति और लॉक स्थिति के बीच उनके सामंजस्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मुख्य प्रोटोकॉल में चार प्रमुख खंड होते हैं – ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तैयारी, सतह तैयारी, इमेजिंग और डेटा विश्लेषण। इस प्रोटोकॉल को हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों द्वारा भोले और सक्रिय ओटी -1 सीडी 8 + टी कोशिकाओं, ओटी -2 सीडी 4 + कोशिकाओं, साथ ही हाइब्रिडोमा में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है, और टी सेल रिसेप्टर, प्रोग्राम्ड सेल डेथ रिसेप्टर (पीडी 1), और लिम्फोसाइट फ़ंक्शन से जुड़े एंटीजन 1 (एलएफए -1) बलों सहित विभिन्न प्रतिरक्षा सेल रिसेप्टर्स से पूछताछ करने के लिए लागू किया जा सकता है। ओटी -1 सीडी 8 + भोले टी कोशिकाओं का उपयोग इस पेपर में एक उदाहरण सेल लाइन के रूप में किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रदान की गई विस्तृत प्रक्रियाओं के साथ, कोई भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित रिसेप्टर तनाव को मैप और मात्रा निर्धारित करने के लिए डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सब्सट्रेट तैयार कर सकता है। जब क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच ग्रांट्स आर 01 जीएम 131099, एनआईएच आर 01 जीएम 124472 और एनएसएफ करियर 1350829 द्वारा समर्थित किया गया था। हम पीएमएचसी लिगेंड के लिए एनआईएच टेट्रामर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को आंशिक रूप से, एमोरी कॉम्प्रिहेंसिव ग्लाइकोमिक्स कोर द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
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