تحليل أنماط حركية السدادة أثناء وبعد تجديد الجهاز الفموي باستخدام تتبع الخلايا
Summary
نقدم بروتوكولا لتوصيف حركية وسلوك مجموعة من مائة خلية بحجم ميكرون إلى ملليمتر باستخدام المجهر الساطع وتتبع الخلايا. يكشف هذا الفحص أن Stentor coeruleus ينتقل عبر أربع مراحل متميزة سلوكيا عند تجديد جهاز فموي مفقود.
Abstract
Stentor coeruleus هو كائن حي نموذجي معروف لدراسة التجديد أحادي الخلية. كشف التحليل النسخي للخلايا الفردية عن مئات الجينات – العديد منها غير مرتبط بالجهاز الفموي (OA) – التي يتم تنظيمها بشكل تفاضلي على مراحل طوال عملية التجديد. كان من المفترض أن إعادة التنظيم المنهجي وتعبئة الموارد الخلوية نحو نمو OA جديد سيؤدي إلى تغييرات ملحوظة في الحركة والسلوك المقابلة في الوقت المناسب لمراحل التعبير الجيني التفاضلي. ومع ذلك ، فإن التعقيد المورفولوجي ل S. coeruleus استلزم تطوير فحص لالتقاط الإحصاءات والجدول الزمني. تم استخدام برنامج نصي مخصص لتتبع الخلايا في مقاطع فيديو قصيرة ، وتم تجميع الإحصاءات على عدد كبير من السكان (N ~ 100). عند فقدان OA ، يفقد S. coeruleus في البداية القدرة على الحركة الموجهة ؛ ثم بدءا من ~ 4 ساعات ، فإنه يظهر انخفاضا كبيرا في السرعة حتى ~ 8 ساعات. يوفر هذا الفحص أداة مفيدة لفحص الأنماط الظاهرية الحركية ويمكن تكييفها للتحقيق في الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) هو كائن حي نموذجي معروف تم استخدامه لدراسة التجديد أحادي الخلية بسبب حجمه الكبير ، وقدرته على تحمل العديد من تقنيات الجراحة المجهرية ، وسهولة الاستزراع في بيئة مختبرية1،2،3. ركزت دراسات التجديد المبكر على أكبر ميزة وأكثرها تميزا من الناحية المورفولوجية في Stentor – OA – التي يتم إلقاؤها بالكامل على الصدمة الكيميائية4،5،6. يبدأ استبدال OA المفقود بظهور نطاق غشائي جديد – مجموعة من الأهداب التي تتحول تدريجيا نحو الجزء الأمامي من الخلية قبل تشكيل OA وظيفي على مدى ثماني مراحل مورفولوجية3. وقد لوحظت هذه المراحل بالتتابع، بغض النظر عن درجة الحرارة، وتوفر نقطة مرجعية عالمية لجميع الدراسات تقريبا5.
يتطلب التحليل الميكانيكي لتجديد Stentor أدوات لقياس توقيت التجديد قوية وبسيطة بما يكفي لتطبيقها على عينات متعددة كجزء من شاشة كيميائية أو جزيئية. الطريقة القياسية لإجراء الفحص القائم على الخلايا هي التصوير ، في هذه الحالة ، تصوير تكوين OA جديد أثناء التجديد. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات القائمة على التصوير تكون أكثر فعالية عندما تحتوي البنية المجددة على مكونات جزيئية متميزة يمكن استخدامها كعلامات ، بحيث يمكن اكتشافها بسهولة في صورة فلورية. في حالة Stentor OA ، توجد المكونات المعروفة (الأهداب ، الأجسام القاعدية) أيضا على بقية سطح الخلية. لذلك ، لا يمكن تحقيق الاعتراف باستعادة النفاذ المفتوح بمجرد البحث عن وجود أو عدم وجود مكون.
بدلا من ذلك ، ستكون هناك حاجة إلى شكل من أشكال التعرف على الشكل للكشف عن OA ، وهذا قد يكون صعبا للغاية بالنظر إلى حقيقة أن خلايا Stentor غالبا ما تغير شكلها عبر عملية انقباض سريعة. تقدم هذه الورقة مقايسة بديلة للتجديد تعتمد على النشاط الحركي للجسم وأهداب الزراعة العضوية المفتوحة. مع تجديد OA ، تخضع الأهداب المشكلة حديثا لتغييرات قابلة للتكرار في الموضع والنشاط ، والتي بدورها تؤثر على حركة السباحة للخلية. من خلال تحليل الحركة ، من الممكن إجراء فحص ل “التجديد الوظيفي” الذي يحدد التجديد كميا عن طريق تحديد وظيفة الهياكل المجددة. استخدم التحليل السابق للدالة الهدبية Stentor أثناء التجديد قياس سرعة صورة الجسيمات ، جنبا إلى جنب مع حبات التتبع المضافة إلى الوسائط الخارجية ، لمراقبة التغيرات في نمط التدفق في مراحل مختلفة من التجديد7 ؛ ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج تصويرا شاقا للخلايا الفردية وحقول التدفق المرتبطة بها ، واحدة تلو الأخرى.
باستخدام حركة الخلية نفسها كوكيل للتدفق الناتج عن الأهداب ، سيكون من الممكن تحليل أعداد أكبر من الخلايا بالتوازي ، باستخدام أنظمة تصوير منخفضة الدقة متوافقة مع منصات الفحص عالية الإنتاجية. يمكن استخدام هذا الفحص ، من حيث المبدأ ، لدراسة التطور والتجديد الوظيفي في الكائنات الحية الأخرى التي تعمل بمئات الميكرونات إلى الملليمترات على نطاق الحجم. يصف القسم 1 من البروتوكول بناء شريحة عينة متعددة الآبار ، والتي تسمح بتصوير عالي الإنتاجية لمجموعة من الخلايا على مدار يوم كامل. يتم توفير تفاصيل حول كيفية الضبط للاستخدام مع أنواع الخلايا الأخرى. يغطي القسم 2 من البروتوكول الحصول على بيانات الفيديو لهذا الفحص ، والتي يمكن إنجازها على مجهر تشريح باستخدام كاميرا انعكاسية رقمية أحادية العدسة. يوفر القسم 3 من البروتوكول تفصيلا لتتبع الخلايا وحساب سرعة الخلية باستخدام رمز MATLAB (المعلومات التكميلية). يشرح القسم 4 من البروتوكول كيفية تحويل النتائج العددية إلى مخططات كما هو موضح في الشكل 1C-F والشكل 2C لسهولة تفسير النتائج.
Protocol
Representative Results
Discussion
توجد حاليا العديد من خوارزميات تتبع الجسيمات والخلايا ، بعضها مجاني تماما. غالبا ما تكون التكلفة وسهولة الاستخدام مقايضات تتطلب حلا وسطا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم العديد من برامج تتبع الخلايا الحالية لتتبع حركة الزحف البطيئة لخلايا زراعة الأنسجة ، بدلا من حركة السباحة السريعة ل Stentor<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل ، جزئيا ، من قبل زمالة ويتمان للمختبر البيولوجي البحري المبكر (JYS). نحن نقدر إيفان بيرنز وميت باتيل وميلاني ميلو وسكايلار ويدمان للمساعدة في بعض التحليلات الأولية واختبار الشفرات. ونشكر مارك سلابودنيك على المناقشة والاقتراحات. تعترف WFM بالدعم المقدم من منحة المعاهد الوطنية للصحة R35 GM130327.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V., Kerkut, G. A. . The Biology of Stentor. , (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
