使用细胞追踪分析口腔器械再生期间和之后的张力模式
Summary
我们提出了一种方案，用于使用明场显微镜和细胞跟踪来表征数百微米至毫米级细胞群的运动性和行为。该测定表明，在再生丢失的口腔器械时， Stentor coeruleus 通过四个行为上不同的阶段过渡。
Abstract
鞘翅目 是一种著名的单细胞再生研究模式生物。单个细胞的转录组学分析揭示了数百个基因 – 许多与口腔器官（OA）无关 – 这些基因在整个再生过程中的各个阶段受到差异调节。据推测，这种系统性重组和细胞资源向新OA生长的动员将导致运动和行为的可观察到的变化，这些变化与差异基因表达的各个阶段相对应。然而， Coeruleus 的形态复杂性使得有必要开发一种测定方法来捕获统计数据和时间尺度。使用自定义脚本在短视频中跟踪细胞，并在大量群体（N ~100）上编译统计数据。在OA丧失后， 科鲁勒斯链球菌 最初失去定向运动的能力;然后从~4小时开始，它表现出速度的显着下降，直到〜8小时。该测定法为筛选运动表型提供了有用的工具，并且可以适用于其他生物体的研究。
Introduction
Stentor coeruleus （Stentor）是一种众所周知的模式生物，由于其体积大，能够承受多种显微外科技术并且易于在实验室环境中培养，因此已被用于研究单细胞再生1，2，3。早期的再生研究集中在 Stentor中最大和形态上最独特的特征 – OA – 它在化学休克4，5，6时完全脱落。从 头 替换丢失的OA始于新膜束带的出现 – 一组纤毛，在八个形态阶段形成功能性OA之前逐渐向细胞前部移动3。无论温度如何，这些阶段都是按顺序观察到的，并为几乎所有研究提供了通用参考点5。
Stentor再生的机械分析需要用于测量再生时间的工具，这些工具足够坚固且简单，可以作为化学或分子筛选的一部分应用于多个样品。进行基于细胞的测定的标准方法是成像，在这种情况下，在再生过程中成像新OA的形成。然而，当再生结构包含可用作标记物的不同分子组分时，这种基于成像的测定是最有效的，因此它们很容易在荧光图像中检测到。在Stentor OA的情况下，已知的成分（纤毛，基底体）也存在于细胞表面的其余部分;因此，识别OA的恢复不能仅仅通过寻找组件的存在与否来实现。
相反，需要某种形式的形状识别来检测OA，鉴于 Stentor 细胞经常通过快速收缩过程改变形状，这可能非常具有挑战性。本文提出了一种依赖于身体和OA纤毛的运动活性的再生替代测定方法。随着OA的再生，新形成的纤毛在位置和活性上经历可重复的变化，这反过来又会影响细胞的游动性。通过分析运动性，可以进行“功能再生”的测定，通过量化再生结构的功能来量化再生。先前对再生过程中 Stentor 纤毛功能的分析使用粒子图像测速法，结合添加到外部介质中的示踪剂珠，以观察再生不同阶段流动模式的变化7;然而，这种方法需要对单个细胞及其相关的流场进行费力的成像，一次一个。
通过使用细胞本身的运动作为纤毛生成流动的代理，可以使用与高通量筛选平台兼容的低分辨率成像系统并行分析大量细胞。原则上，该测定可用于研究其他游泳生物体在数百微米至毫米大小的规模的发育和功能再生。该协议的第1部分描述了多孔样品载玻片的构造，该载玻片允许在长达一整天的时间内对细胞群进行高通量成像。提供了有关如何调整以用于其他细胞类型的详细信息。该协议的第2部分涵盖了该测定的视频数据的采集，这可以在带有数字单镜头反光相机的解剖显微镜上完成。该协议的第3部分提供了使用MATLAB代码（补充信息）进行细胞跟踪和细胞速度计算的演练。该协议的第4部分解释了如何将数字结果转换为图1C-F和图2C所示的图，以便于解释结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
目前存在许多粒子和细胞跟踪算法，其中一些是完全免费的。成本和用户友好性通常是需要妥协的权衡。此外，许多现有的细胞跟踪程序被设计为跟踪组织培养细胞的缓慢爬行运动，而不是Stentor的快速游泳运动， Stentor在游泳时旋转并可能经历突然的方向变化。在测试了许多这些选项之后，这里介绍的协议旨在成为一站式解决方案，仅使用低成本设备和单个科学软件包（材料表</strong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了海洋生物实验室惠特曼早期职业奖学金（JYS）的部分支持。我们感谢埃文·伯恩斯、米特·帕特尔、梅兰妮·梅洛和斯凯拉·威德曼帮助进行了一些初步分析和代码测试。我们感谢马克·斯拉博德尼克的讨论和建议。WFM感谢NIH拨款R35 GM130327的支持。
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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