Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire
Summary
Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.
Abstract
Stentor coeruleus est un organisme modèle bien connu pour l’étude de la régénération unicellulaire. L’analyse transcriptomique de cellules individuelles a révélé des centaines de gènes – dont beaucoup ne sont pas associés à l’appareil buccal (OA) – qui sont régulés différemment par phases tout au long du processus de régénération. On a émis l’hypothèse que cette réorganisation systémique et cette mobilisation des ressources cellulaires vers la croissance d’une nouvelle arthrose entraîneront des changements observables dans le mouvement et le comportement correspondant dans le temps aux phases d’expression différentielle des gènes. Cependant, la complexité morphologique de S. coeruleus a nécessité le développement d’un test pour capturer les statistiques et l’échelle de temps. Un script personnalisé a été utilisé pour suivre les cellules dans de courtes vidéos, et des statistiques ont été compilées sur une grande population (N ~ 100). Lors de la perte de l’OA, S. coeruleus perd initialement la capacité de mouvement dirigé; puis à partir de ~4 h, il présente une baisse significative de vitesse jusqu’à ~8 h. Ce test fournit un outil utile pour le dépistage des phénotypes de motilité et peut être adapté pour l’étude d’autres organismes.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) est un organisme modèle bien connu qui a été utilisé pour étudier la régénération unicellulaire en raison de sa grande taille, de sa capacité à résister à plusieurs techniques microchirurgicales et de sa facilité de culture en laboratoire 1,2,3. Les premières études de régénération se sont concentrées sur la caractéristique la plus importante et la plus morphologiquement distincte de Stentor – l’ARTH – qui est complètement éliminée lors d’un choc chimique 4,5,6. Le remplacement de novo d’une arthrose perdue commence par l’émergence d’une nouvelle bande membranellelle, un ensemble de cils qui se déplacent progressivement vers l’avant de la cellule avant de former une arthrose fonctionnelle au cours de huit stades morphologiques3. Ces étapes ont été observées séquentiellement, quelle que soit la température, et constituent un point de référence universel pour presque toutes les études5.
L’analyse mécaniste de la régénération stentor nécessite des outils de mesure du moment de la régénération qui sont suffisamment robustes et simples pour être appliqués à plusieurs échantillons dans le cadre d’un criblage chimique ou moléculaire. La méthode standard pour effectuer un test cellulaire est l’imagerie, dans ce cas, l’imagerie de la formation d’une nouvelle arthrose pendant la régénération. Cependant, de tels tests basés sur l’imagerie sont plus efficaces lorsque la structure régénérante contient des composants moléculaires distincts qui peuvent être utilisés comme marqueurs, de sorte qu’ils seraient facilement détectés dans une image de fluorescence. Dans le cas du Stentor OA, les composants connus (cils, corps basaux) sont également présents sur le reste de la surface cellulaire ; par conséquent, la reconnaissance de la restauration de l’accès ouvert ne peut être obtenue simplement en recherchant la présence ou l’absence d’un composant.
Au contraire, une certaine forme de reconnaissance de forme serait nécessaire pour détecter une arthrose, ce qui est potentiellement très difficile étant donné que les cellules Stentor changent souvent de forme via un processus contractile rapide. Cet article présente un test alternatif pour la régénération qui repose sur l’activité mobile du corps et des cils OA. Au fur et à mesure que l’arthrose se régénère, les cils nouvellement formés subissent des changements reproductibles de position et d’activité, ce qui affecte la motilité de nage de la cellule. En analysant la motilité, il est possible d’effectuer un test de « régénération fonctionnelle » qui quantifie la régénération en quantifiant la fonction des structures régénérées. L’analyse antérieure de la fonction ciliaire de Stentor pendant la régénération utilisait la vélocimétrie d’image de particules, combinée à des billes traceuses ajoutées au milieu externe, pour observer les changements dans le schéma d’écoulement à différents stades de la régénération7; cependant, cette approche nécessite une imagerie laborieuse des cellules individuelles et de leurs champs d’écoulement associés, une à la fois.
En utilisant le mouvement de la cellule elle-même comme proxy pour le flux généré par les cils, il serait possible d’analyser un plus grand nombre de cellules en parallèle, en utilisant des systèmes d’imagerie à basse résolution compatibles avec les plates-formes de criblage à haut débit. Ce test peut, en principe, être utilisé pour étudier le développement et la régénération fonctionnelle chez d’autres organismes nageurs à l’échelle des centaines de microns à millimètres. La section 1 du protocole décrit la construction d’une lame d’échantillon multipuits, qui permet l’imagerie à haut débit d’une population de cellules sur une journée entière. Des détails sont fournis sur la façon de s’ajuster pour une utilisation avec d’autres types de cellules. La section 2 du protocole couvre l’acquisition de données vidéo pour ce test, qui peut être réalisée sur un microscope à dissection avec un appareil photo reflex numérique à objectif unique. La section 3 du protocole fournit une procédure pas à pas du suivi des cellules et du calcul de la vitesse des cellules à l’aide du code MATLAB (informations supplémentaires). La section 4 du protocole explique comment transformer les résultats numériques en graphiques, comme le montrent les figures 1C-F et 2C pour faciliter l’interprétation des résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreux algorithmes de suivi des particules et des cellules existent actuellement, certains entièrement gratuits. Le coût et la convivialité sont souvent des compromis qui nécessitent des compromis. De plus, de nombreux programmes de suivi cellulaire existants sont conçus pour suivre le mouvement lent des cellules de culture tissulaire, plutôt que le mouvement de nage rapide de Stentor, qui tourne pendant la natation et peut subir des changements soudains de direction. Après avoir testé bon nombre de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu, en partie, par le Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Nous remercions Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo et Skylar Widman pour leur aide dans l’analyse préliminaire et les tests de code. Nous remercions Mark Slabodnick pour ses discussions et ses suggestions. WFM reconnaît le soutien de la subvention R35 GM130327 des NIH.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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