세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

Summary

우리는 밝은 필드 현미경 검사 및 세포 추적을 사용하여 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 세포 집단의 운동성과 행동을 특성화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 Stentor coeruleus 가 잃어버린 구강 장치를 재생할 때 네 가지 행동 적으로 별개의 단계를 통해 전환한다는 것을 보여줍니다.

Abstract

스텐터 코에룰루스 는 단세포 재생 연구를 위한 잘 알려진 모델 유기체이다. 개별 세포에 대한 전사체 분석은 재생 과정 전반에 걸쳐 단계적으로 차별적으로 조절되는 수백 개의 유전자 (많은 구강 장치 (OA)와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 새로운 OA의 성장을 향한 세포 자원의 이러한 전신 재구성 및 동원이 차등 유전자 발현의 단계에 시간에 상응하는 이동 및 행동의 관찰 가능한 변화를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 그러나 S. coeruleus 의 형태 학적 복잡성으로 인해 통계와 시간 척도를 포착하기위한 분석의 개발이 필요했습니다. 사용자 지정 스크립트를 사용하여 짧은 비디오에서 셀을 추적하고 통계가 많은 인구 (N ~ 100)에 걸쳐 컴파일되었습니다. OA를 잃으면 S. coeruleus 는 처음에는 지시 된 움직임에 대한 능력을 상실합니다. 그런 다음 ~ 4 h에서 시작하여 ~ 8 시간까지 속도가 크게 떨어집니다. 이 분석은 운동성 표현형의 스크리닝에 유용한 도구를 제공하며 다른 유기체의 조사에 적합 할 수 있습니다.

Introduction

스텐터 코에룰루스(Stentor)는 크기가 크고, 여러 미세수술 기술을 견딜 수 있는 능력, 실험실 세팅 ^1,2,3에서 배양의 용이성으로 인해 단세포 재생을 연구하는 데 사용되어 온 잘 알려진 모델 유기체이다. 초기 재생 연구는 스텐터 (Stentor)에서 가장 크고 형태 학적으로 구별되는 특징 인 OA에 초점을 맞추 었으며, 이는 화학 충격 ^4,5,6에 완전히 흘려^집니다. 잃어버린 OA의 De novo 대체는 새로운 막질 밴드의 출현으로 시작됩니다 - 여덟 가지 형태 학적 단계³에 걸쳐 기능적 OA를 형성하기 전에 점차적으로 세포의 앞쪽으로 이동하는 섬모 배열. 이들 단계는 온도에 관계없이 순차적으로 관찰되었으며, 거의 모든 연구⁵에 대한 보편적인 기준점을 제공한다.

Protocol

주: 대략 백 개의 S. 코에룰루스 세포의 집단을 이전에 공개된 JoVE 프로토콜⁸에 따라 배양하였다.

1. 시료 준비

1. 250 μm 두께의 실리콘 스페이서 시트 (재료 표)의 조각을 현미경 슬라이드보다 높이와 너비 모두에서 약간 작게 자릅니다. 5/16" 구멍 펀치를 사용하여 원형 웰을 만듭니다. 좋은 밀봉을 보장하기 위해 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 두는 것에 유의하십시오.
   참고: 이웃 우물 사이에 3mm의 공간이 충분한 것으로 확인되었습니다. 연습을 통해 열 개의 웰을 단일 샘플 슬라이드에 배치 할 수 있습니다.
2. 세포를 2분 동안 10% 수크로오스 또는 2% 우레아에서 인큐베이션함으로써 OA의 재생을 개시한다(도 1A). 그런 다음 신선한 배지⁸로 세 번 씻으십시오. 각 웰에 약 열 개의 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 볼륨과 가능한 한 가깝게 일치시키는 것을 조심하십시오.
   참고: 여기에 사용된 웰 치수에 대해, 12.5 μL의 샘플을 각 웰 내로 피펫팅하였다.
....

Results

이 분석의 목표는 큰 (N ~ 100) 재생 스텐터 집단 내에서 세포로부터의 이동 패턴의 점진적 변화와 이동 속도의 단계적 증가를 정량화하는 것입니다. 결과 해석을 돕기 위해 이 프로토콜에 포함된 사용자 지정 코드는 비디오 데이터 집합의 모든 셀 이동 추적의 오버레이(그림 1C-F 및 그림 S1)와 재생성 시작 이후 시간별 수영 속도 플롯의 두 가지 유형의 플롯을 생성합니다(그림 2C). 정상적으로 재생되는 스텐터 인구는 방향없는 수영에서 방향 수영으로의 꾸준한 전환을 입증해야합니다 (그림 1G). 각 세포는 ~ 8 h에 걸친 OA 재생 과정 동안이 전이를 완전히 겪지 만, 개인 간의 변화는 추세가 명확 해지기 위해 총체적으로 큰 집단의 움직임을 볼.......

Discussion

많은 입자 및 세포 추적 알고리즘이 현재 존재하며 일부는 완전히 무료입니다. 비용과 사용자 친화성은 종종 타협이 필요한 절충안입니다. 또한, 기존의 많은 세포 추적 프로그램은 수영하는 동안 회전하고 갑작스런 방향 변화를 겪을 수있는 스텐터의 빠른 수영 운동보다는 조직 배양 세포의 느린 크롤링 움직임을 추적하도록 설계되었습니다. 이러한 많은 옵션을 테스트 한 후 여기에 제시된 프로토콜은 저비용 장비와 단일 과학 소프트웨어 패키지 (Table of Materials)만을 사용하여 데이터 수집에서 데이터 시각화에 이르기까지 모든 과정을 진행할 수있는 원 스톱 솔루션이되도록 고안되었습니다. 이것은 학생들이 자신의 질문을하고 짧은 시간 내에 양적 결과에 도달하는 장벽을 낮추기 때문에 필요한 장비의 대부분이 이미 사용 가능한 교육 중심 기관 또는 생물 물리학 교육 실험실의 연구 실험실에 특히 중요합니다.

이 원고에 제시된 방법은 수백 미크론에서.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25mm 두께의 실리콘 시트	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50mm, #1.5 커버글라스	Fisher Scientific	NC1034527	논의에서 언급했듯이 하나의 슬라이드에 더 적은 수의 샘플 웰을 배치하면 더 작은 커버글라스를 사용할 수 있습니다.
CCD 카메라			Nikon D750
Chlamydomonas 137c, WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB, Image Processing Toolbox	MATHWORKS		를 사용했습니다.