ניתוח דפוסי תנועתיות של סטנטור במהלך ואחרי התחדשות מנגנון הפה באמצעות מעקב אחר תאים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לאפיון תנועתיות והתנהגות של אוכלוסייה של תאים בגודל של מאה מיקרון עד מילימטר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ומעקב אחר תאים. בדיקה זו מגלה כי Stentor coeruleus עובר דרך ארבעה שלבים שונים מבחינה התנהגותית כאשר הוא מחדש מנגנון אוראלי אבוד.
Abstract
Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל ידוע לחקר ההתחדשות החד-תאית. ניתוח תעתיק של תאים בודדים גילה מאות גנים – רבים מהם אינם קשורים למנגנון הפה (OA) – המווסתים באופן דיפרנציאלי בשלבים לאורך תהליך ההתחדשות. ההשערה הייתה כי ארגון מחדש מערכתי זה וגיוס משאבים תאיים לקראת צמיחה של OA חדש יובילו לשינויים נצפים בתנועה ובהתנהגות המתאימים בזמן לשלבים של ביטוי גנים דיפרנציאליים. עם זאת, המורכבות המורפולוגית של S. coeruleus חייבה פיתוח של מבחן כדי ללכוד את הסטטיסטיקה ואת ציר הזמן. סקריפט מותאם אישית שימש למעקב אחר תאים בסרטונים קצרים, וסטטיסטיקות נאספו על פני אוכלוסייה גדולה (N ~ 100). עם אובדן ה- OA, S. coeruleus מאבד בתחילה את היכולת לתנועה מכוונת; ואז מתחיל ב~ 4 שעות, הוא מציג ירידה משמעותית במהירות עד ~ 8 שעות. בדיקה זו מספקת כלי שימושי לסינון של פנוטיפים של תנועתיות וניתן להתאים אותה לחקירת אורגניזמים אחרים.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) הוא אורגניזם מודל ידוע ששימש לחקר התחדשות חד-תאית בשל גודלו הגדול, יכולתו לעמוד במספר טכניקות מיקרו-כירורגיות וקלות התרבות בסביבת מעבדהשל 1,2,3. מחקרי התחדשות מוקדמים התמקדו בתכונה הגדולה והמורפולוגית המורפולוגית הגדולה ביותר בסטנטור – ה-OA – אשר נשפכת לחלוטין על הלם כימי 4,5,6. החלפת דה נובו של OA אבוד מתחילה עם הופעתה של רצועת ממברנה חדשה – מערך של ריסונים הנעים בהדרגה לכיוון החלק הקדמי של התא לפני שהם יוצרים OA פונקציונלי על פני שמונה שלבים מורפולוגיים3. שלבים אלה נצפו ברצף, ללא קשר לטמפרטורה, ומספקים נקודת ייחוס אוניברסלית כמעט לכל המחקרים5.
ניתוח מכניסטי של התחדשות סטנטור דורש כלים למדידת תזמון ההתחדשות שהם חזקים ופשוטים מספיק כדי להיות מיושמים על דגימות מרובות כחלק ממסך כימי או מולקולרי. השיטה הסטנדרטית לביצוע בדיקה מבוססת תאים היא הדמיה, במקרה זה, הדמיה של היווצרות OA חדש במהלך התחדשות. עם זאת, מבחנים מבוססי הדמיה כאלה יעילים ביותר כאשר המבנה המתחדש מכיל רכיבים מולקולריים מובחנים שיכולים לשמש כסמנים, כך שהם יזוהו בקלות בתמונה פלואורסצנטית. במקרה של Stentor OA, הרכיבים הידועים (ריסונים, גופים בסיסיים) נמצאים גם על שאר פני השטח של התא; לכן, הכרה בשיקום של OA לא יכולה להיות מושגת פשוט על ידי חיפוש נוכחות או היעדר של רכיב.
במקום זאת, תידרש צורה כלשהי של זיהוי צורה כדי לזהות OA, וזה עלול להיות מאתגר מאוד בהתחשב בעובדה שתאי סטנטור לעתים קרובות משנים צורה באמצעות תהליך כיווץ מהיר. מאמר זה מציג בדיקה חלופית להתחדשות המסתמכת על פעילות תנועתית של הגוף וריסוני OA. כאשר ה- OA מתחדש, הריסונים החדשים שנוצרו עוברים שינויים הניתנים לשחזור במיקום ובפעילות, אשר בתורם משפיעים על תנועתיות השחייה של התא. על ידי ניתוח תנועתיות, ניתן לבצע בדיקה עבור “התחדשות פונקציונלית” המכמתת התחדשות על ידי כימות הפונקציה של המבנים המתחדשים. ניתוח קודם של תפקוד Stentor ciliary במהלך התחדשות השתמש בוולוצימטריה של תמונת חלקיקים, בשילוב עם חרוזי עקיבה שנוספו למדיה החיצונית, כדי לבחון שינויים בתבנית הזרימה בשלבים שונים של התחדשות7; עם זאת, גישה זו דורשת הדמיה מייגעת של תאים בודדים ושדות הזרימה הקשורים אליהם, בזה אחר זה.
על ידי שימוש בתנועת התא עצמו כפרוקסי לזרימה שנוצרה על ידי ריסונים, ניתן יהיה לנתח מספר גדול יותר של תאים במקביל, באמצעות מערכות הדמיה ברזולוציה נמוכה התואמות לפלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה. בדיקה זו יכולה, באופן עקרוני, לשמש לחקר התפתחות והתחדשות תפקודית באורגניזמים שוחים אחרים בקנה מידה של מאות מיקרונים עד מילימטרים. סעיף 1 של הפרוטוקול מתאר את בנייתה של שקופית דגימה רב-תחומית, המאפשרת הדמיה בתפוקה גבוהה של אוכלוסיית תאים במשך עד יום שלם. מפורטים כיצד להתאים את עצמם לשימוש עם סוגי תאים אחרים. חלק 2 של הפרוטוקול מכסה את רכישת נתוני הווידאו עבור בדיקה זו, אשר ניתן לבצע על מיקרוסקופ דיסקציה עם מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת. סעיף 3 של הפרוטוקול מספק מעבר של מעקב אחר תאים וחישוב מהירות התא באמצעות קוד MATLAB (מידע משלים). סעיף 4 של הפרוטוקול מסביר כיצד להפוך את התוצאות המספריות לחלקות כפי שמוצג באיור 1C-F ובאיור 2C לפענוח קל של התוצאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיימים כיום אלגוריתמים רבים למעקב אחר חלקיקים ותאים, חלקם חופשיים לחלוטין. עלות וידידותיות למשתמש הן לעתים קרובות פשרות הדורשות פשרה. בנוסף, רבות מתוכניות המעקב הקיימות אחר תאים נועדו לעקוב אחר תנועת זחילה איטית של תאי תרבית רקמה, במקום תנועת השחייה המהירה של סטנטור, שמסתובבת תוך כדי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מלגת ויטמן לקריירה מוקדמת במעבדה הביולוגית הימית (JYS). אנו מודים לאוון ברנס, מיט פאטל, מלאני מלו וסקיילר וידמן על שעזרו בחלק מהניתוח הראשוני ובדיקת הקוד. אנו מודים למארק סלבודניק על הדיון וההצעות. WFM מכיר בתמיכה ממענק NIH R35 GM130327.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V., Kerkut, G. A. . The Biology of Stentor. , (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
