सेल ट्रैकिंग का उपयोग करके मौखिक उपकरण पुनर्जनन के दौरान और बाद में स्टेंटर के गतिशीलता पैटर्न का विश्लेषण
Summary
हम ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और सेल ट्रैकिंग का उपयोग करके सौ माइक्रोन से मिलीमीटर आकार की कोशिकाओं की आबादी की गतिशीलता और व्यवहार के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस परख से पता चलता है कि स्टेंटर कोएरुलस एक खोए हुए मौखिक तंत्र को पुनर्जीवित करते समय चार व्यवहारिक रूप से अलग-अलग चरणों के माध्यम से संक्रमण करता है।
Abstract
स्टेंटर कोएरुलस एककोशिकीय उत्थान के अध्ययन के लिए एक प्रसिद्ध मॉडल जीव है। व्यक्तिगत कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से सैकड़ों जीनों का पता चला– कई मौखिक तंत्र (ओए) से जुड़े नहीं हैं- जो पुनर्जनन प्रक्रिया के दौरान चरणों में अलग-अलग विनियमित होते हैं। यह परिकल्पना की गई थी कि एक नए ओए के विकास की दिशा में सेलुलर संसाधनों के इस प्रणालीगत पुनर्गठन और जुटाने से अंतर जीन अभिव्यक्ति के चरणों के अनुरूप आंदोलन और व्यवहार में अवलोकन योग्य परिवर्तन होंगे। हालांकि, एस कोएरुलस की रूपात्मक जटिलता ने आंकड़ों और टाइमस्केल को पकड़ने के लिए एक परख के विकास की आवश्यकता थी। लघु वीडियो में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था, और आंकड़े एक बड़ी आबादी (एन ~ 100) पर संकलित किए गए थे। ओए के नुकसान पर, एस कोएरुलस शुरू में निर्देशित गति की क्षमता खो देता है; फिर ~ 4 घंटे से शुरू होकर, यह ~ 8 घंटे तक गति में एक महत्वपूर्ण गिरावट प्रदर्शित करता है। यह परख गतिशीलता फेनोटाइप की स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है और अन्य जीवों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
स्टेंटर कोएरुलस (स्टेंटर) एक प्रसिद्ध मॉडल जीव है जिसका उपयोग अपने बड़े आकार, कई माइक्रोसर्जिकल तकनीकों का सामना करने की क्षमता और प्रयोगशाला सेटिंग 1,2,3 में संवर्धन में आसानी के कारण एककोशिकीय उत्थान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। प्रारंभिक उत्थान अध्ययन स्टेंटर में सबसे बड़ी और सबसे रूपात्मक रूप से विशिष्ट विशेषता पर केंद्रित है- ओए- जो पूरी तरह से रासायनिक सदमे 4,5,6 पर बहाया जाता है। खोए हुए ओए का डे नोवो प्रतिस्थापन एक नए झिल्लीदार बैंड के उद्भव के साथ शुरू होता है- सिलिया की एक सरणी जो धीरे-धीरे आठ रूपात्मक चरणों में एक कार्यात्मक ओए बनाने से पहले सेल के पूर्वकाल की ओर स्थानांतरित होजाती है 3. इन चरणों को तापमान की परवाह किए बिना क्रमिक रूप से देखा गया है, और लगभग सभी अध्ययनों के लिए एक सार्वभौमिक संदर्भ बिंदु प्रदान करतेहैं 5.
स्टेंटर पुनर्जनन के यंत्रवत विश्लेषण के लिए पुनर्जनन के समय को मापने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है जो रासायनिक या आणविक स्क्रीन के हिस्से के रूप में कई नमूनों पर लागू होने के लिए पर्याप्त मजबूत और सरल होते हैं। सेल-आधारित परख करने के लिए मानक विधि इमेजिंग है, इस मामले में, पुनर्जनन के दौरान नए ओए के गठन की इमेजिंग। हालांकि, इस तरह के इमेजिंग-आधारित परख सबसे प्रभावी होते हैं जब पुनर्जन्म संरचना में अलग-अलग आणविक घटक होते हैं जिन्हें मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि उन्हें प्रतिदीप्ति छवि में आसानी से पता लगाया जा सके। स्टेंटर ओए के मामले में, ज्ञात घटक (सिलिया, बेसल निकाय) सेल की सतह के बाकी हिस्सों पर भी मौजूद हैं; इसलिए, ओए की बहाली को पहचानना केवल एक घटक की उपस्थिति या अनुपस्थिति की तलाश करके प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
इसके बजाय, ओए का पता लगाने के लिए आकार मान्यता के कुछ रूप की आवश्यकता होगी, और यह संभवतः इस तथ्य को देखते हुए बहुत चुनौतीपूर्ण है कि स्टेंटर कोशिकाएं अक्सर तेजी से सिकुड़ा हुआ प्रक्रिया के माध्यम से आकार बदलती हैं। यह पत्र पुनर्जनन के लिए एक वैकल्पिक परख प्रस्तुत करता है जो शरीर और ओए सिलिया की गतिशील गतिविधि पर निर्भर करता है। जैसे ही ओए पुनर्जीवित होता है, नवगठित सिलिया स्थिति और गतिविधि में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिवर्तनों से गुजरता है, जो बदले में, सेल की तैराकी गतिशीलता को प्रभावित करता है। गतिशीलता का विश्लेषण करके, “कार्यात्मक उत्थान” के लिए एक परख करना संभव है जो पुनर्जीवित संरचनाओं के कार्य को मापकर उत्थान की मात्रा निर्धारित करता है। उत्थान के दौरान स्टेंटर सिलिअरी फ़ंक्शन का पिछला विश्लेषण बाहरी मीडिया में जोड़े गए ट्रेसर मोतियों के साथ संयुक्त कण छवि वेलोसिमेट्री का उपयोग करता है, पुनर्जनन के विभिन्न चरणों में प्रवाह पैटर्न में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए7; हालाँकि, इस दृष्टिकोण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं और उनके संबंधित प्रवाह क्षेत्रों की श्रमसाध्य इमेजिंग की आवश्यकता होती है, एक समय में एक।
सिलिया-जनित प्रवाह के लिए प्रॉक्सी के रूप में सेल की गति का उपयोग करके, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के साथ संगत कम-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके समानांतर में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का विश्लेषण करना संभव होगा। इस परख, सिद्धांत रूप में, मिलीमीटर आकार के पैमाने के लिए माइक्रोन के सैकड़ों में अन्य तैराकी जीवों में विकास और कार्यात्मक उत्थान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की धारा 1 एक मल्टीवेल नमूना स्लाइड के निर्माण का वर्णन करती है, जो पूरे दिन तक कोशिकाओं की आबादी के उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग की अनुमति देती है। अन्य सेल प्रकारों के साथ उपयोग के लिए समायोजित करने के तरीके के लिए विवरण प्रदान किए जाते हैं। प्रोटोकॉल की धारा 2 इस परख के लिए वीडियो डेटा के अधिग्रहण को कवर करती है, जिसे डिजिटल सिंगल-लेंस रिफ्लेक्स कैमरा के साथ विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर पूरा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की धारा 3 मैटलैब कोड (पूरक जानकारी) का उपयोग करके सेल ट्रैकिंग और सेल गति गणना का वॉक-थ्रू प्रदान करती है। प्रोटोकॉल की धारा 4 बताती है कि परिणामों की आसान व्याख्या के लिए चित्रा 1 सी-एफ और चित्रा 2 सी में दिखाए गए अनुसार संख्यात्मक परिणामों को भूखंडों में कैसे बदलना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई कण और सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम वर्तमान में मौजूद हैं, कुछ पूरी तरह से मुक्त हैं। लागत और उपयोगकर्ता-मित्रता अक्सर व्यापार-नापसंद होते हैं जिन्हें समझौता करने की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कई मौ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को समुद्री जैविक प्रयोगशाला व्हिटमैन अर्ली कैरियर फैलोशिप (जेवाईएस) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम प्रारंभिक विश्लेषण और कोड परीक्षण में से कुछ में मदद करने के लिए इवान बर्न्स, मिट पटेल, मेलानी मेलो और स्काईलर विडमैन को स्वीकार करते हैं। हम चर्चा और सुझावों के लिए मार्क स्लैबोनिक को धन्यवाद देते हैं। डब्ल्यूएफएम एनआईएच अनुदान आर 35 जीएम 130327 से समर्थन स्वीकार करता है।
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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