Analyse av motilitetsmønstre av stentor under og etter oral apparatregenerering ved bruk av cellesporing

Summary

Vi presenterer en protokoll for karakterisering av motilitet og oppførsel av en populasjon på hundre mikron- til millimeterstørrelsesceller ved hjelp av lysfeltmikroskopi og cellesporing. Denne analysen avslører at Stentor coeruleus overgår gjennom fire atferdsmessig forskjellige faser når man regenererer et tapt oralt apparat.

Abstract

Stentor coeruleus er en velkjent modellorganisme for studiet av encellet regenerering. Transkriptomisk analyse av individuelle celler avslørte hundrevis av gener – mange ikke assosiert med det orale apparatet (OA) – som er differensielt regulert i faser gjennom regenereringsprosessen. Det ble antatt at denne systemiske omorganiseringen og mobiliseringen av cellulære ressurser mot vekst av en ny OA vil føre til observerbare endringer i bevegelse og oppførsel som tilsvarer i tid til fasene av differensiell genuttrykk. Imidlertid nødvendiggjorde den morfologiske kompleksiteten til S. coeruleus utviklingen av en analyse for å fange statistikken og tidsskalaen. Et tilpasset skript ble brukt til å spore celler i korte videoer, og statistikk ble samlet over en stor befolkning (N ~ 100). Ved tap av OA mister S. coeruleus i utgangspunktet evnen til rettet bevegelse; deretter starter på ~ 4 h, viser den en betydelig hastighetsfall til ~ 8 timer. Denne analysen gir et nyttig verktøy for screening av motilitetsfenotyper og kan tilpasses for undersøkelse av andre organismer.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) er en velkjent modellorganisme som har blitt brukt til å studere encellet regenerering på grunn av sin store størrelse, evne til å motstå flere mikrokirurgiske teknikker og enkel dyrking i en laboratorieinnstilling ^1,2,3. Tidlige regenereringsstudier fokuserte på den største og mest morfologisk distinkte egenskapen i Stentor-OA-som kastes helt på kjemisk sjokk ^4,5,6. De novo erstatning av en tapt OA begynner med fremveksten av et nytt membranellarbånd – en rekke cilia som gradvis skifter mot fremre av cellen før de danner en funksjonell OA over åtte morfologiske stadier³. Disse stadiene er observert sekvensielt, uavhengig av temperatur, og gir et universelt referansepunkt for nesten alle studier⁵.

Mekanistisk analyse av stentorregenerering krever verktøy for å måle tidspunktet for regenerering som er robuste og enkle nok til å brukes på flere prøver som en del av en kjemisk eller molekylær skjerm. Standardmetoden for å utføre en cellebasert analyse er avbildning, i dette tilfellet avbildning av dannelsen av ny OA under regenerering. Imidlertid er slike bildebaserte analyser mest effektive når den regenererende strukturen inneholder forskjellige molekylære komponenter som kan brukes som markører, slik at de lett kan oppdages i et fluorescensbilde. Når det gjelder Stentor OA, er de kjente komponentene (cilia, basallegemer) også tilstede på resten av celleoverflaten; Derfor kan anerkjennelse av restaureringen av OA ikke oppnås bare ved å lete etter tilstedeværelse eller fravær av en komponent.

Snarere vil det være nødvendig med en form for formgjenkjenning for å oppdage en OA, og dette er potensielt svært utfordrende gitt det faktum at Stentor-celler ofte endrer form via en rask kontraktil prosess. Dette papiret presenterer en alternativ analyse for regenerering som er avhengig av kroppens motile aktivitet og OA-cilia. Når OA regenererer, gjennomgår de nydannede cilia reproduserbare endringer i posisjon og aktivitet, noe som igjen påvirker cellens svømmemotilitet. Ved å analysere motilitet er det mulig å utføre en analyse for “funksjonell regenerering” som kvantifiserer regenerering ved å kvantifisere funksjonen til de regenererte strukturer. Tidligere analyse av Stentor ciliary funksjon under regenerering brukte partikkelbilde velocimetry, kombinert med tracer perler lagt til eksterne medier, for å observere endringer i strømningsmønster på ulike stadier av regenerering⁷; Denne tilnærmingen krever imidlertid møysommelig avbildning av individuelle celler og deres tilhørende strømningsfelt, en om gangen.

Ved å bruke bevegelsen av selve cellen som en proxy for cilia-generert strømning, ville det være mulig å analysere større antall celler parallelt, ved hjelp av lavoppløselige bildesystemer som er kompatible med høy gjennomstrømningsscreeningsplattformer. Denne analysen kan i prinsippet brukes til å studere utvikling og funksjonell regenerering i andre svømmende organismer i hundrevis av mikron til millimeter størrelse skala. Seksjon 1 i protokollen beskriver konstruksjonen av et multiwell prøveglass, som muliggjør høy gjennomstrømningsavbildning av en populasjon av celler over opptil en hel dag. Detaljer er gitt for hvordan du justerer for bruk med andre celletyper. Seksjon 2 i protokollen dekker innsamling av videodata for denne analysen, som kan oppnås på et disseksjonsmikroskop med et digitalt speilreflekskamera. Seksjon 3 i protokollen gir en gjennomgang av cellesporing og beregning av cellehastighet ved bruk av MATLAB-kode (Tilleggsinformasjon). Del 4 i protokollen forklarer hvordan man gjør de numeriske resultatene om til plott som vist i figur 1C-F og figur 2C for enkel tolkning av resultatene.

Protocol

MERK: En populasjon på omtrent hundre S. coeruleus-celler ble dyrket i samsvar med en tidligere publisert JoVE-protokoll8. 1. Forberedelse av prøver Klipp et stykke 250 μm tykt silikonavstandsark (Table of Materials) litt mindre i både høyde og bredde enn et mikroskopglass. Bruk en 5/16 “hullstans, lag sirkulære brønner. Vær oppmerksom på å forlate tilstrekkelig plass mellom nærliggende brønner for å sikre en god tetning….

Representative Results

Målet med denne analysen er å kvantifisere den gradvise endringen av bevegelsesmønstre og faset økning i bevegelseshastighet fra celler i en stor (N ~ 100) regenererende stentorpopulasjon. For å hjelpe tolkningen av resultatene genererer den tilpassede koden som er inkludert i denne protokollen to typer plott: et overlegg av alle cellebevegelsesspor i et sett med videodata (figur 1C-F og figur S1), og et plott av svømmehastigh…

Discussion

Mange partikkel- og cellesporingsalgoritmer eksisterer for tiden, noen helt gratis. Kostnader og brukervennlighet er ofte kompromisser som krever kompromisser. I tillegg er mange av de eksisterende cellesporingsprogrammene designet for å spore langsom krypende bevegelse av vevskulturceller, i stedet for Stentors raske svømmebevegelse, som roterer mens du svømmer og kan gjennomgå plutselige retningsendringer. Etter å ha testet mange av disse alternativene, er protokollen som presenteres her ment å være en …

Materials

0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center