Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular

Summary

Apresentamos um protocolo para a caracterização da motilidade e comportamento de uma população de cem células de tamanho mícnico a milímetro usando microscopia de campo brilhante e rastreamento celular. Este ensaio revela que Stentor coeruleus transita por quatro fases comportamentalmente distintas ao regenerar um aparelho oral perdido.

Abstract

Stentor coeruleus é um organismo modelo bem conhecido para o estudo da regeneração unicelular. A análise transcriômica de células individuais revelou centenas de genes — muitos não associados ao aparelho oral (OA) — que são regulados diferencialmente em fases ao longo do processo de regeneração. Foi a hipótese de que essa reorganização sistêmica e mobilização de recursos celulares para o crescimento de um novo OA levará a mudanças observáveis de movimento e comportamento correspondentes no tempo às fases da expressão genética diferencial. No entanto, a complexidade morfológica de S. coeruleus exigiu o desenvolvimento de um ensaio para capturar as estatísticas e a escala de tempo. Um script personalizado foi usado para rastrear células em vídeos curtos, e as estatísticas foram compiladas sobre uma grande população (N ~100). Após a perda do OA, S. coeruleus inicialmente perde a capacidade de movimento direcionado; em seguida, a partir de ~4 h, ele exibe uma queda significativa na velocidade até ~8 h. Este ensaio fornece uma ferramenta útil para a triagem de fenótipos de motilidade e pode ser adaptado para a investigação de outros organismos.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) é um organismo modelo bem conhecido que tem sido usado para estudar a regeneração unicelular devido ao seu grande tamanho, capacidade de suportar várias técnicas microcirúrgicas e facilidade de cultivo em um ambiente de laboratório ^1,2,3. Os primeiros estudos de regeneração concentraram-se na maior e mais morfologicamente distinta característica em Stentor — o OA — que é completamente derramado após choque químico ^4,5,6. A substituição de novo de um OA perdido começa com o surgimento de uma nova faixa membranalar — uma matriz de cílios que gradualmente se deslocam para o anterior da célula antes de formar um OA funcional ao longo de oito estágios morfológicos³. Esses estágios têm sido observados sequencialmente, independentemente da temperatura, e fornecem um ponto de referência universal para quase todos os estudos⁵.

A análise mecanicista da regeneração de Stentor requer ferramentas para medir o tempo de regeneração que são robustas e simples o suficiente para serem aplicadas a múltiplas amostras como parte de uma tela química ou molecular. O método padrão para a realização de um ensaio baseado em células é a imagem, neste caso, de imagem da formação de novo OA durante a regeneração. No entanto, tais ensaios baseados em imagens são mais eficazes quando a estrutura regeneradora contém componentes moleculares distintos que podem ser usados como marcadores, de modo que eles seriam facilmente detectados em uma imagem de fluorescência. No caso do Stentor OA, os componentes conhecidos (cílios, corpos basais) também estão presentes no resto da superfície celular; portanto, reconhecer a restauração do OA não pode ser alcançado simplesmente procurando a presença ou ausência de um componente.

Em vez disso, alguma forma de reconhecimento de forma seria necessária para detectar um OA, e isso é potencialmente muito desafiador dado o fato de que as células Stentor muitas vezes mudam de forma através de um processo de contração rápida. Este artigo apresenta um ensaio alternativo para a regeneração que se baseia na atividade motil do corpo e da OA cilia. À medida que o OA se regenera, os cílios recém-formados sofrem mudanças reprodutíveis de posição e atividade, o que, por sua vez, afeta a motilidade de natação da célula. Analisando a motilidade, é possível realizar um ensaio para a “regeneração funcional” que quantifica a regeneração quantificando a função das estruturas regeneradas. Análise prévia da função ciliária de Stentor durante a regeneração usou velocimetria de imagem de partículas, combinada com contas de rastreador adicionadas à mídia externa, para observar mudanças no padrão de fluxo em diferentes estágios de regeneração⁷; no entanto, essa abordagem requer imagens laboriosas de células individuais e seus campos de fluxo associados, um de cada vez.

Usando o movimento da própria célula como um proxy para o fluxo gerado por cílios, seria possível analisar um número maior de células em paralelo, usando sistemas de imagem de baixa resolução compatíveis com plataformas de triagem de alto rendimento. Este ensaio pode, em princípio, ser usado para estudar o desenvolvimento e a regeneração funcional em outros organismos de natação nas centenas de mícrons a milímetros de tamanho. A seção 1 do protocolo descreve a construção de um slide de amostra de vários poços, que permite imagens de alto rendimento de uma população de células ao longo de um dia inteiro. Detalhes são fornecidos sobre como ajustar para uso com outros tipos de células. A seção 2 do protocolo abrange a aquisição de dados de vídeo para este ensaio, que pode ser realizado em um microscópio de dissecção com uma câmera reflexo de lente única digital. A seção 3 do protocolo fornece um passo-a-passo do rastreamento celular e cálculo da velocidade celular usando o código MATLAB (Informações Suplementares). A seção 4 do protocolo explica como transformar os resultados numéricos em parcelas como mostrado na Figura 1C-F e Figura 2C para fácil interpretação dos resultados.

Protocol

NOTA: Uma população de aproximadamente cem células S. coeruleus foram cultivadas de acordo com um protocolo JoVE publicado anteriormente8. 1. Preparação da amostra Corte um pedaço de 250 μm de espessura da folha espaçadora de silicone (Tabela de Materiais) ligeiramente menor em altura e largura do que um slide de microscópio. Usando um furo de 5/16″, crie poços circulares. Tenha cuidado de deixar espaço suficiente entre os …

Representative Results

O objetivo deste ensaio é quantificar a mudança gradual dos padrões de movimento e o aumento gradual da velocidade de movimento das células dentro de uma grande (N ~100) regenerando a população de Stentor. Para auxiliar a interpretação dos resultados, o código personalizado incluído neste protocolo gera dois tipos de parcelas: uma sobreposição de todos os traços de movimento celular em um conjunto de dados de vídeo (Figura 1C-F e <stro…

Discussion

Muitos algoritmos de rastreamento de partículas e células existem atualmente, alguns totalmente livres. Custo e simpatia do usuário são muitas vezes trocas que requerem compromisso. Além disso, muitos dos programas de rastreamento celular existentes são projetados para rastrear o movimento lento de rastreamento das células da cultura tecidual, em vez do movimento de natação rápida de Stentor, que gira durante a natação e pode sofrer mudanças repentinas de direção. Depois de testar muitas dessas op…

Materials

0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center