Analys av motilitetsmönster av stentor under och efter oral apparatregenerering med hjälp av cellspårning

Summary

Vi presenterar ett protokoll för karakterisering av rörlighet och beteende hos en population av hundra mikron- till millimeterstora celler med hjälp av ljusfältmikroskopi och cellspårning. Denna analys avslöjar att Stentor coeruleus övergår genom fyra beteendemässigt distinkta faser när man regenererar en förlorad oral apparat.

Abstract

Stentor coeruleus är en välkänd modellorganism för studier av encellig regenerering. Transkriptomisk analys av enskilda celler avslöjade hundratals gener – många som inte är associerade med den orala apparaten (OA) – som regleras differentiellt i faser under hela regenereringsprocessen. Det antogs att denna systemiska omorganisation och mobilisering av cellulära resurser mot tillväxt av en ny OA kommer att leda till observerbara förändringar i rörelse och beteende som i tid motsvarar faserna av differentiellt genuttryck. Den morfologiska komplexiteten hos S. coeruleus krävde emellertid utvecklingen av en analys för att fånga statistiken och tidsskalan. Ett anpassat skript användes för att spåra celler i korta videor, och statistik sammanställdes över en stor befolkning (N ~ 100). Vid förlust av OA förlorar S. coeruleus initialt förmågan till riktad rörelse; sedan börjar vid ~ 4 h, uppvisar den en betydande hastighetsminskning fram till ~ 8 h. Denna analys ger ett användbart verktyg för screening av motilitetsfenotyper och kan anpassas för undersökning av andra organismer.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) är en välkänd modellorganism som har använts för att studera encellig regenerering på grund av dess stora storlek, förmåga att motstå flera mikrokirurgiska tekniker och lätthet att odla i laboratoriemiljö ^1,2,3. Tidiga regenereringsstudier fokuserade på den största och mest morfologiskt distinkta egenskapen hos Stentor – OA – som kastas helt på kemisk chock ^4,5,6. De novo-ersättning av en förlorad OA börjar med framväxten av ett nytt membranllarband – en uppsättning cilia som gradvis skiftar mot cellens främre del innan den bildar en funktionell OA över åtta morfologiska steg³. Dessa steg har observerats sekventiellt, oavsett temperatur, och ger en universell referenspunkt för nästan alla studier⁵.

Mekanistisk analys av Stentor-regenerering kräver verktyg för att mäta tidpunkten för regenerering som är robusta och enkla nog att appliceras på flera prover som en del av en kemisk eller molekylär skärm. Standardmetoden för att utföra en cellbaserad analys är avbildning, i detta fall avbildning av bildandet av ny OA under regenerering. Sådana avbildningsbaserade analyser är dock mest effektiva när den regenererande strukturen innehåller distinkta molekylära komponenter som kan användas som markörer, så att de lätt skulle detekteras i en fluorescensbild. När det gäller Stentor OA är de kända komponenterna (cilia, basala kroppar) också närvarande på resten av cellytan; Därför kan erkännande av återställandet av OA inte uppnås helt enkelt genom att leta efter närvaron eller frånvaron av en komponent.

Snarare skulle någon form av formigenkänning krävas för att detektera en OA, och detta är potentiellt mycket utmanande med tanke på att Stentorceller ofta ändrar form via en snabb kontraktil process. Detta papper presenterar en alternativ analys för regenerering som är beroende av kroppens rörliga aktivitet och OA-cilia. När OA regenererar genomgår de nybildade cilia reproducerbara förändringar i position och aktivitet, vilket i sin tur påverkar cellens simmotilitet. Genom att analysera rörlighet är det möjligt att utföra en analys för “funktionell regenerering” som kvantifierar regenerering genom att kvantifiera funktionen hos de regenererade strukturerna. Tidigare analys av Stentor ciliary funktion under regenerering använde partikelbildvelocimetri, i kombination med spårpärlor som tillsattes till det externa mediet, för att observera förändringar i flödesmönster vid olika stadier av regenerering⁷; detta tillvägagångssätt kräver dock mödosam avbildning av enskilda celler och deras associerade flödesfält, en i taget.

Genom att använda själva cellens rörelse som en proxy för cilia-genererat flöde skulle det vara möjligt att analysera ett större antal celler parallellt med hjälp av lågupplösta bildsystem som är kompatibla med screeningplattformar med hög genomströmning. Denna analys kan i princip användas för att studera utveckling och funktionell regenerering i andra simmande organismer i hundratals mikron till millimeter skala. Avsnitt 1 i protokollet beskriver konstruktionen av en flerbrunnsprovglas, vilket möjliggör avbildning med hög genomströmning av en population av celler under upp till en hel dag. Detaljer finns för hur du justerar för användning med andra celltyper. Avsnitt 2 i protokollet täcker insamling av videodata för denna analys, vilket kan åstadkommas på ett dissektionsmikroskop med en digital reflexkamera med en lins. Avsnitt 3 i protokollet ger en genomgång av cellspårning och cellhastighetsberäkning med MATLAB-kod (kompletterande information). Avsnitt 4 i protokollet förklarar hur man omvandlar de numeriska resultaten till diagram som visas i figur 1C-F och figur 2C för enkel tolkning av resultaten.

Protocol

OBS: En population av cirka hundra S. coeruleus-celler odlades i enlighet med ett tidigare publicerat JoVE-protokoll8. 1. Beredning av prover Skär en bit 250 μm tjock silikondistansplåt (Materialtabell) något mindre i både höjd och bredd än ett mikroskopglas. Använd en 5/16 ” hålslagning, skapa cirkulära brunnar. Var uppmärksam på att lämna tillräckligt med utrymme mellan angränsande brunnar för att säkerställa en br…

Representative Results

Målet med denna analys är att kvantifiera den gradvisa förändringen av rörelsemönster och fasad ökning av rörelsehastigheten från celler inom en stor (N ~ 100) regenererande Stentor-population. För att underlätta tolkningen av resultaten genererar den anpassade koden som ingår i detta protokoll två typer av diagram: ett överlägg av alla cellrörelsespår i en uppsättning videodata (figur 1C-F och figur S1) och ett di…

Discussion

Många partikel- och cellspårningsalgoritmer finns för närvarande, vissa helt gratis. Kostnad och användarvänlighet är ofta avvägningar som kräver kompromisser. Dessutom är många av de befintliga cellspårningsprogrammen utformade för att spåra långsam kryprörelse av vävnadsodlingsceller, snarare än Stentors snabba simrörelse, som roterar medan du simmar och kan genomgå plötsliga riktningsförändringar. Efter att ha testat många av dessa alternativ är protokollet som presenteras här avsett…

Materials

0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m
MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m
Microscope with camera port			We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E
Pasteurized Spring Water	Carolina	132458
TAP Growth Media	ThermoFisher Scientific	A1379801	Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center