Hücre İzleme Kullanılarak Oral Aparat Rejenerasyonu Sırasında ve Sonrasında Stentor Motilite Paternlerinin Analizi
Summary
Parlak alan mikroskobu ve hücre takibi kullanılarak yüz mikron ila milimetre büyüklüğünde hücrelerden oluşan bir popülasyonun hareketliliğinin ve davranışının karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, Stentor coeruleus’un kayıp bir oral aparatı yenilerken davranışsal olarak farklı dört aşamadan geçtiğini ortaya koymaktadır.
Abstract
Stentor coeruleus , tek hücreli rejenerasyon çalışmaları için iyi bilinen bir model organizmadır. Bireysel hücrelerin transkriptomik analizi, çoğu oral aparat (OA) ile ilişkili olmayan yüzlerce geni ortaya çıkardı – rejenerasyon süreci boyunca fazlar halinde farklı şekilde düzenlenmiştir. Hücresel kaynakların bu sistemik yeniden düzenlenmesi ve yeni bir OA’nın büyümesine doğru mobilizasyonunun, zaman içinde diferansiyel gen ekspresyonunun fazlarına karşılık gelen hareket ve davranışta gözlemlenebilir değişikliklere yol açacağı varsayılmıştır. Bununla birlikte, S. coeruleus’un morfolojik karmaşıklığı, istatistikleri ve zaman ölçeğini yakalamak için bir tahlilin geliştirilmesini gerektirmiştir. Kısa videolardaki hücreleri izlemek için özel bir komut dosyası kullanıldı ve istatistikler büyük bir popülasyon (N ~ 100) üzerinden derlendi. OA’nın kaybedilmesi üzerine, S. coeruleus başlangıçta yönlendirilmiş hareket yeteneğini kaybeder; daha sonra ~ 4 saatten başlayarak, ~ 8 saate kadar hızda önemli bir düşüş gösterir. Bu tahlil, motiliteli fenotiplerin taranması için yararlı bir araç sağlar ve diğer organizmaların araştırılması için uyarlanabilir.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor), büyük boyutu, çeşitli mikrocerrahi tekniklere dayanma kabiliyeti ve laboratuvar ortamında kültürleme kolaylığı nedeniyle tek hücreli rejenerasyonu incelemek için kullanılan iyi bilinen bir model organizmadır 1,2,3. Erken rejenerasyon çalışmaları, Stentor’daki en büyük ve morfolojik olarak en belirgin özelliğe odaklanmıştır – OA – tamamen kimyasal şok 4,5,6 üzerine dökülür. Kayıp bir OA’nın de novo replasmanı, sekiz morfolojik aşamada fonksiyonel bir OA oluşturmadan önce yavaş yavaş hücrenin ön tarafına doğru kayan yeni bir membranllar bandın ortaya çıkmasıyla başlar3. Bu aşamalar, sıcaklıktan bağımsız olarak sırayla gözlemlenmiştir ve neredeyse tüm çalışmalar için evrensel bir referans noktası sağlamaktadır5.
Stentor rejenerasyonunun mekanik analizi, rejenerasyonun zamanlamasını ölçmek için kimyasal veya moleküler bir ekranın parçası olarak birden fazla numuneye uygulanabilecek kadar sağlam ve basit araçlar gerektirir. Hücre bazlı bir tahlil yapmak için standart yöntem, bu durumda, rejenerasyon sırasında yeni OA oluşumunu görüntülemektir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme tabanlı analizler, yenileyici yapı belirteçler olarak kullanılabilecek farklı moleküler bileşenler içerdiğinde en etkilidir, böylece bir floresan görüntüsünde kolayca tespit edilebilirler. Stentor OA durumunda, bilinen bileşenler (kirpikler, bazal cisimler) hücre yüzeyinin geri kalanında da bulunur; bu nedenle, AE’nin restorasyonunu tanımak, sadece bir bileşenin varlığını veya yokluğunu arayarak elde edilemez.
Daha ziyade, bir OA’yı tespit etmek için bir çeşit şekil tanıma gerekli olacaktır ve Stentor hücrelerinin sıklıkla hızlı bir kasılma süreci yoluyla şekil değiştirdiği gerçeği göz önüne alındığında, bu potansiyel olarak çok zordur. Bu yazıda, vücudun hareketli aktivitesine ve OA kirpiklerine dayanan rejenerasyon için alternatif bir test sunulmaktadır. OA yenilendikçe, yeni oluşan kirpikler pozisyon ve aktivitede tekrarlanabilir değişikliklere uğrar ve bu da hücrenin yüzme hareketliliğini etkiler. Hareketliliği analiz ederek, yenilenen yapıların işlevini nicelleştirerek rejenerasyonu ölçen “fonksiyonel rejenerasyon” için bir test yapmak mümkündür. Rejenerasyon sırasında Stentor siliyer fonksiyonunun önceki analizi, rejenerasyonun farklı aşamalarında akış modelindeki değişiklikleri gözlemlemek için dış ortama eklenen izleyici boncuklarla birlikte partikül görüntü velosimetrisi kullandı7; Bununla birlikte, bu yaklaşım, tek tek hücrelerin ve bunlarla ilişkili akış alanlarının birer birer zahmetli bir şekilde görüntülenmesini gerektirir.
Hücrenin kendisinin hareketini kirpik kaynaklı akış için bir proxy olarak kullanarak, yüksek verimli tarama platformlarıyla uyumlu düşük çözünürlüklü görüntüleme sistemlerini kullanarak daha fazla sayıda hücreyi paralel olarak analiz etmek mümkün olacaktır. Bu tahlil, prensip olarak, yüzlerce mikron ila milimetre boyut ölçeğinde diğer yüzme organizmalarında gelişim ve fonksiyonel rejenerasyonu incelemek için kullanılabilir. Protokolün 1. Bölümü, bir hücre popülasyonunun tüm güne kadar yüksek verimli görüntülenmesini sağlayan çok kuyulu bir örnek slaytının yapımını açıklamaktadır. Diğer hücre türleriyle kullanım için nasıl ayarlanacağına ilişkin ayrıntılar sağlanmıştır. Protokolün 2. Bölümü, dijital tek lensli refleks kamera ile diseksiyon mikroskobunda gerçekleştirilebilen bu test için video verilerinin elde edilmesini kapsamaktadır. Protokolün 3. Bölümü, MATLAB kodunu (Ek Bilgiler) kullanarak hücre izleme ve hücre hızı hesaplaması hakkında bir kılavuz sağlar. Protokolün 4. Bölümü, sonuçların kolay yorumlanması için sayısal sonuçların Şekil 1C-F ve Şekil 2C’de gösterildiği gibi grafiklere nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok parçacık ve hücre izleme algoritması şu anda mevcuttur, bazıları tamamen ücretsizdir. Maliyet ve kullanım kolaylığı genellikle ödün vermeyi gerektiren ödünleşimlerdir. Ek olarak, mevcut hücre izleme programlarının çoğu, yüzerken dönen ve ani yön değişikliklerine uğrayabilen Stentor’un hızlı yüzme hareketi yerine, doku kültürü hücrelerinin yavaş sürünen hareketini izlemek için tasarlanmıştır. Bu seçeneklerin çoğunu test ettikten sonra, burada sunulan protokolü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Deniz Biyolojisi Laboratuvarı Whitman Erken Kariyer Bursu (JYS) tarafından desteklenmiştir. Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo ve Skylar Widman’a bazı ön analiz ve kod testlerinde yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Mark Slabodnick’e tartışma ve öneriler için teşekkür ederiz. WFM, NIH hibesi R35 GM130327’nin desteğini kabul eder.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V., Kerkut, G. A. . The Biology of Stentor. , (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
