차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜
Summary
여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.
Abstract
마그네틱 비즈와 자동화된 DNA 추출 기기를 사용하여 최근에 발표된 DNA 추출 프로토콜은 다운스트림 전체 게놈 시퀀싱에 충분한 잘 보존된 개별 모기로부터 고품질 및 수량 DNA를 추출할 수 있음을 시사했습니다. 그러나 고가의 자동화 된 DNA 추출 기기에 대한 의존은 많은 실험실에서 금지 될 수 있습니다. 여기서, 연구 결과는 저중간 처리량에 적합한 예산 친화적인 자기 비드 기지를 둔 DNA 추출 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 Aedes aegypti 모기 견본을 사용하여 성공적으로 시험되었습니다. 고품질 DNA 추출과 관련된 비용 절감은 자원 제한된 실험실 및 연구에 높은 처리량 시퀀싱의 적용을 증가시킬 것이다.
Introduction
최근 개선된 DNA 추출 프로토콜1의 개발로 전체 게놈 시퀀싱2,3,4,5,6을포함하는 많은 고충격 다운스트림 연구를허용하고있다. 이 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 개별 모기 샘플에서 신뢰할 수있는 DNA 수율을 제공하므로 필드 수집에서 충분한 수의 샘플을 획득하는 데 드는 비용과 시간을 줄입니다.
인구와 조경 유전체학의 최근 발전은 전체 게놈 시퀀싱의 비용 감소와 직접적으로 상관관계가 있습니다. 이전 DNA 추출 프로토콜1은 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 효율성을 증가하지만, 자금이없는 작은 실험실 / 연구는 프로토콜 (예를 들어, 특수 기기의 비용)을 구현하는 비용으로 인해 이러한 새로운 강력한 풍경 및 인구 유전체 학 도구를 사용하지 않을 수 있습니다.
여기서, 수정된 DNA 추출 프로토콜은 Neiman외. 1과 유사한 자기 비드 추출 단계를 사용하여 고순도 DNA를 얻지만 조직 용해 및 DNA 추출을 위한 고비용 기기에 의존하지 않는다는 것을 제시한다. 이 프로토콜은 고품질 DNA의 >10 ng를 요구하는 실험에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 다른 곤충 종에 맞게 조정할 수 있다. Nieman 외1에 도입 된 프로토콜의원래 버전은 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, 아노펠레스 아라비엔시스, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 미국이 자금을 지원하는 벡터 매개 질병에 대한 우수의 태평양 남서부 지역 센터의 자금 지원을 인정합니다. 질병통제예방센터(협력계약 1U01CK0000516), CDC 보조금 NU50CK000420-04-04, USDA 국립식품농업연구소(해치 프로젝트 1025565), UF/IFAS 플로리다 메디컬 곤충학 연구소 펠로우십 Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC 단계 II 보조금(AWD05009_MOD0030), 플로리다 보건부(CoQ) 이 문서의 결과와 결론은 저자의 결과이며 반드시 미국 어류 및 야생 동물 서비스의 견해를 나타내지는 않습니다.
Materials
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
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