μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo
Summary
Het artikel introduceert het μTongue (microfluidics-on-a-tongue) apparaat voor functionele smaakcelbeeldvorming in vivo door microfluïdica te integreren in een intravitaal beeldvormingsvenster op de tong.
Abstract
Intravitale fluorescentiemicroscopie is een hulpmiddel dat op grote schaal wordt gebruikt om meercellige dynamica in een levend dier te bestuderen. Het is echter niet met succes gebruikt in het smaaksensorische orgaan. Door microfluïdica te integreren in het intravitale tongbeeldvormingsvenster, biedt de μTongue betrouwbare functionele beelden van smaakcellen in vivo bij gecontroleerde blootstelling aan meerdere smaakstoffen. In dit artikel wordt een gedetailleerde stapsgewijze procedure gepresenteerd om het μTongue-systeem te gebruiken. Er zijn vijf subsecties: voorbereiden van smakelijke oplossingen, opzetten van een microfluïdische module, monstermontage, verkrijgen van functionele beeldgegevens en gegevensanalyse. Enkele tips en technieken om de praktische problemen op te lossen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van de μTongue worden ook gepresenteerd.
Introduction
De intravitale fluorescentiemicroscoop wordt veel gebruikt om de spatiotemporale dynamiek op levende weefsels te bestuderen. Onderzoekers ontwikkelen snel genetisch gecodeerde sensoren die specifieke en gevoelige transformaties van de biologische processen in fluorescentiesignalen bieden – die gemakkelijk kunnen worden geregistreerd met behulp van fluorescentiemicroscopen die op grote schaal beschikbaar zijn1,2. Hoewel de meeste inwendige organen bij knaagdieren zijn onderzocht met behulp van de microscoop, is de succesvolle toepassing ervan op de tong nog niet succesvol geweest3.
Eerdere studies naar de calciumbeeldvorming van smaakcellen werden ex vivo uitgevoerd door een tongweefsel dun te sectien om circumvallaat smaakpapillen te verkrijgen4,5,6 of door het smaakepitheel af te pellen om fungiforme smaakpapillen te verkrijgen7,8. De voorbereiding van deze monsters was onvermijdelijk invasief, dus de natuurlijke micro-omgevingen zoals zenuwinnervatie, permeabiliteitsbarrières en bloedcirculatie werden grotendeels verstoord. Het eerste intravitale tongbeeldvormingsvenster werd in 2015 gerapporteerd door Choi et al., maar betrouwbare functionele opname was niet haalbaar vanwege de beweging en optische artefacten veroorzaakt door fluïde smaakstofstimuli9.
Onlangs werd microfluïdica-op-een-tong (μTongue) geïntroduceerd10. Dit apparaat integreert een microfluïdisch systeem met een beeldvenster op de muizentong. Door gedurende de hele beeldvormingsperiode een quasi-steady-state stroom van smakelijke stimuli te bereiken, konden artefacten van vloeiende bewegingen worden geminimaliseerd(figuur 1). De ingangspoort wordt gevoed door een reeks meerkanaals drukregelaars, terwijl de uitgangspoort is aangesloten op een spuitpomp, die 0,3 ml / min behoudt. Bovendien werden optische artefacten veroorzaakt door het verschil in brekingsindices van smaakoplossingen geminimaliseerd door ratiometrische analyse die een calciumongevoelige indicator (tdTomato) en de calciumindicator (GCaMP6) introduceerde11. Dit ontwerp zorgde voor microscopische stabiliteit van smaakcellen in vivo, zelfs bij abrupt schakelen tussen vloeistofkanalen. Bijgevolg implementeert de μTongue een betrouwbare functionele screening van meerdere smaakstoffen op de smaakpapillen van de muis in vivo.
In dit protocol worden de experimentele procedures in detail uitgelegd voor calciumbeeldvorming van de fungiforme smaakpapillen van muizen in vivo met behulp van μTongue. Eerst wordt de bereiding van kunstmatig speeksel en smakelijke oplossingen beschreven. Ten tweede wordt het opzetten van het microfluïdische systeem geïntroduceerd om de quasi-steady-state flow te bereiken. Ten derde worden de procedures die worden gebruikt om de muizentong op de μTongue te monteren om beeldacquisitie mogelijk te maken, afgebakend. Ten slotte wordt elke stap voor beeldanalyse, inclusief correctie van laterale bewegingsartefacten en ratiometrie, gespecificeerd. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk onderzoekslaboratorium met een muisfaciliteit en een microscoop met twee fotonen of gelijkwaardige apparatuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om μTongue toe te passen op het onderzoek naar functionele activiteiten van smaakcellen in vivo. In dit protocol wordt de functionele beeldvorming op de smaakcellen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgevoerd. Naast het gebruik van transgene muizen kan de elektroforetische belasting van calciumkleurstoffen (of spanningsgevoelige kleurstoffen) op de smaakcellen een alternatieve optie zijn.
Alle smaakoplossingen van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789), en door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (nr. 2019M3E5D2A01058329). We zijn Eunsoo Kim en Eugene Lee dankbaar voor hun technische assistentie.
Materials
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O’Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
