μTongue: una piattaforma di imaging funzionale basata sulla microfluidica per la lingua in vivo
Summary
L’articolo introduce il dispositivo μTongue (microfluidica su una lingua) per l’imaging funzionale delle cellule gustative in vivo integrando la microfluidica in una finestra di imaging intravitale sulla lingua.
Abstract
La microscopia a fluorescenza intravitale è uno strumento ampiamente utilizzato per studiare la dinamica multicellulare in un animale vivo. Tuttavia, non è stato utilizzato con successo nell’organo sensoriale del gusto. Integrando la microfluidica nella finestra di imaging della lingua intravitale, μTongue fornisce immagini funzionali affidabili delle cellule del gusto in vivo sotto esposizione controllata a più detastanti. In questo documento, viene presentata una procedura dettagliata passo-passo per utilizzare il sistema μTongue. Ci sono cinque sottosezioni: preparazione di soluzioni tastant, creazione di un modulo microfluidico, montaggio del campione, acquisizione di dati di immagine funzionali e analisi dei dati. Vengono inoltre presentati alcuni suggerimenti e tecniche per risolvere i problemi pratici che possono sorgere quando si utilizza la μTongue.
Introduction
Il microscopio a fluorescenza intravitale è ampiamente utilizzato per studiare le dinamiche spaziotemporali sui tessuti viventi. I ricercatori stanno rapidamente sviluppando sensori geneticamente codificati che forniscono trasformazioni specifiche e sensibili dei processi biologici in segnali di fluorescenza – che possono essere registrati facilmente utilizzando microscopi a fluorescenza che sono ampiamente disponibili1,2. Sebbene la maggior parte degli organi interni nei roditori siano stati studiati utilizzando il microscopio, la sua applicazione di successo alla lingua non ha ancora avuto successo3.
Precedenti studi sull’imaging del calcio delle cellule del gusto sono stati condotti ex vivo sezionando un tessuto della lingua per ottenere papille gustative circumvallate4,5,6 o staccando l’epitelio gustatico per ottenere papille gustative fungiformi7,8. La preparazione di questi campioni era inevitabilmente invasiva, quindi i microambienti naturali come l’innervazione dei nervi, le barriere di permeabilità e la circolazione sanguigna erano in gran parte perturbati. La prima finestra di imaging della lingua intravitale è stata segnalata nel 2015 da Choi et al., ma una registrazione funzionale affidabile non era raggiungibile a causa del movimento e degli artefatti ottici causati dagli stimoli tastanti fluidici9.
Recentemente, la microfluidica su una lingua (μTongue) è stata introdotta10. Questo dispositivo integra un sistema microfluidico con una finestra di imaging sulla lingua del mouse. Raggiungendo un flusso quasi stazionario di stimoli tastanti per tutto il periodo di imaging, gli artefatti del movimento fluidico potrebbero essere ridotti al minimo (Figura 1). La porta di ingresso è alimentata da una serie di regolatori di pressione multicanale, mentre la porta di uscita è collegata a una pompa a siringa, che mantiene 0,3 ml / min. Inoltre, gli artefatti ottici causati dalla differenza negli indici di rifrazione delle soluzioni tastant sono stati ridotti al minimo dall’analisi quantoometrica introducendo un indicatore insensibile al calcio (tdTomato) e l’indicatore del calcio (GCaMP6)11. Questo design ha fornito la stabilità microscopica delle cellule del gusto in vivo anche con bruschi passaggi tra canali fluidici. Di conseguenza, la μTongue implementa uno screening funzionale affidabile di più degustanti alle papille gustative del topo in vivo.
In questo protocollo, le procedure sperimentali sono spiegate in dettaglio per l’imaging del calcio delle papille gustative fungiformi del topo in vivo usando μTongue. In primo luogo, viene descritta la preparazione di saliva artificiale e soluzioni tastant. In secondo luogo, viene introdotta la creazione del sistema microfluidico per raggiungere il flusso quasi stazionario. In terzo luogo, vengono delineate le procedure utilizzate per montare la linguetta del mouse sulla μTongue per consentire l’acquisizione dell’immagine. Infine, viene specificato ogni passaggio per l’analisi delle immagini, compresa la correzione degli artefatti di movimento laterale e la ratiometria. Questo protocollo può essere adattato facilmente a qualsiasi laboratorio di ricerca con una struttura per topi e un microscopio a due fotoni o apparecchiature equivalenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui è descritto un protocollo dettagliato per applicare μTongue allo studio delle attività funzionali delle cellule del gusto in vivo. In questo protocollo, viene eseguita l’imaging funzionale sulle cellule del gusto utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati. Oltre all’uso di topi transgenici, il carico elettroforetico di coloranti di calcio (o coloranti sensibili alla tensione) sulle cellule del gusto può essere un’opzione alternativa.
In questo esperimento sono s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019M3A9E2061789) e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019M3E5D2A01058329). Siamo grati a Eunsoo Kim e Eugene Lee per la loro assistenza tecnica.
Materials
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O’Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
