Här presenterar vi ett protokoll för kryogen provberedning och överföring av kristaller till vakuumstationen på beamline I23 vid Diamond Light Source, för makromolekylära röntgenkristallografiexperiment med lång våglängd.
Makromolekylär kristallografi med lång våglängd (MX) utnyttjar de avvikande spridningsegenskaperna hos element, såsom svavel, fosfor, kalium, klor eller kalcium, som ofta förekommer i makromolekyler. Detta möjliggör en direkt strukturlösning av proteiner och nukleinsyror genom experimentell infasning utan behov av ytterligare märkning. För att eliminera den betydande luftabsorptionen av röntgenstrålar i denna våglängdsregim utförs dessa experiment i en vakuummiljö. Beamline I23 på Diamond Light Source, Storbritannien, är det första synkrotroninstrumentet i sitt slag, designat och optimerat för MX-experiment i det långa våglängdsområdet mot 5 Å.
För att göra detta möjligt omsluter ett stort vakuumkärl alla ändstationskomponenter i provmiljön. Behovet av att hålla prover vid kryogena temperaturer under lagring och datainsamling i vakuum kräver användning av termiskt ledande provhållare. Detta underlättar effektiv värmeborttagning för att säkerställa provkylning till cirka 50 K. I det nuvarande protokollet beskrivs de förfaranden som används för provberedning och överföring av prover till vakuum på strållinje I23. För att säkerställa enhetlighet i praxis och metoder som redan fastställts inom makromolekylär kristallografigemenskapen kan provkylning till flytande kvävetemperatur utföras i alla laboratorieregioner utrustade med standard MX-verktyg.
Kryogen lagring och transport av prover kräver endast standard kommersiellt tillgänglig utrustning. Specialiserad utrustning krävs för överföring av kryogeniskt kylda kristaller från flytande kväve till vakuumstationen. Skräddarsydda provhanteringsverktyg och ett dedikerat kryogent överföringssystem (CTS) har utvecklats internt. Uppgifter om uppgift som samlats in på prover som utarbetats med hjälp av detta protokoll visar utmärkt sammanslagningsstatistik som visar att provernas kvalitet inte är oförändrad under förfarandet. Detta öppnar unika möjligheter för in-vacuum MX i ett våglängdsområde utöver vanliga synkrotronbalklinjer.
Långvågig röntgendiffraktion används för att utnyttja de avvikande spridningsegenskaperna hos specifika ljusatomer som finns i makromolekyler. Detta hjälper till att lösa problemet med den kristallografiska fasen och att otvetydigt bekräfta identiteten och platsen för sådana element inom makromolekyler. Medan de novo-strukturer i början av makromolekylär kristallografi löstes genom flera isomorfa ersättningar1, med tillkomsten av tunable röntgenstrålningsstrålar vid synkrotroner, experimentell fasning baserad på multivåglängd och envåglängd (SAD) avvikande diffraktionstekniker har blivit de dominerande metoderna2 . Båda metoderna har historiskt förlitat sig på den isomorfa eller avvikande signalen från tungmetaller, som måste introduceras artificiellt i kristallerna genom samkristallisering eller kristall blötläggning3. Trial-and-error-metoden och oförutsägbara resultatet kan göra dessa experiment frustrerande tidskrävande. Införlivandet av seleno-metionin under proteinuttryck4 är ett mycket elegant sätt att övervinna dessa begränsningar och utnyttja avvikande diffraktion vid korta våglängder, även om det kan vara mycket utmanande i eukaryota proteinuttryckssystem.
MX med lång våglängd är extremt tilltalande för strukturbestämning genom inhemska SAD-experiment5,6 på grund av bekvämligheten med att använda kristaller direkt från en framgångsrik kristalliseringsstudie utan ytterligare behandling. Dessutom öppnar tillgång till absorptionskanterna för element av hög biologisk betydelse, såsom kalcium, kalium, klor, svavel och fosfor, möjligheten att direkt identifiera positionerna för dessa element i makromolekyler7,8,9,10. Vid medelhög och låg upplösning kan elementtilldelning baserad på 2Fo-Fc elektrontäthet och kemisk miljö vara svårt, särskilt för element med liknande antal elektroner eller svagt bundna joner med partiell beläggning. Dessa tvetydigheter kan lösas genom att samla in data under och över absorptionskanten för intresseelementet och tolkningen av den resulterande modellfasade avvikande skillnaden Fourier maps11,12. Att lokalisera svavelatomerpositioner i dessa kartor kan också hjälpa modellbyggande till lågupplösta elektrontäthetskartor13. Absorptionskanterna för dessa ljuselement observeras vid våglängder mellan λ = 3 och 6 Å (se figur 1, överst). Detta våglängdsområde har varit långt bortom kapaciteten hos någon synkrotron MX-strållinje, och effektiv drift i detta intervall kräver att man övervinner flera tekniska utmaningar, som beskrivs nedan.
Beamline I23 på Diamond Light Source, Storbritannien, är ett unikt instrument, speciellt utformat för att underlätta MX-experiment med lång våglängd, tunable i ett våglängdsområde mellan λ = 1,13 och 5,9 Å (energiområde mellan E = 2,1 och 11 keV). Genom att verka i en miljö med hög vakuum14 elimineras luftabsorption och spridning, vilket ökar effektiviteten hos diffraktionsexperiment och signal-till-brus-förhållandet. En stor vakuumändstation omsluter alla komponenter i provmiljön, inklusive den halvcylindriska Pilatus 12M-detektorn, en fleraxlig goniometer, online-visnings- och kollideringssystemen samt skräddarsydd utrustning för överföring och lagring av prover (figur 2). Varje utrustning har optimerats för att säkerställa att data av lång våglängd av bästa kvalitet kan samlas in. Den böjda Pilatus 12M-detektorn kan samla in till diffraktionsvinklar på 2θ = ±100°, vilket resulterar i tillräckligt högupplösta diffraktionsdata även vid längsta våglängder (figur 1, botten). De 120 detektormodulerna har valts specifikt för lågenergikompatibilitet och kalibreringar för ett extra ultrahögt förstärkningsläge har tillhandahållits.
Lägsta möjliga detektortröskel är 1,8 keV, vilket leder till ökade hörn- och kanteffekter för energier som är lägre än 3,6 keV och komprometterad datakvalitet vid de längsta våglängderna, särskilt för kristaller med låg mosaik, kan observeras. Denna effekt i kombination med minskningen av detektorns kvanteffektivitet15 måste beaktas vid planeringen av ett experiment. Den fleraxliga goniometern möjliggör omorientering av kristaller för att möjliggöra datainsamlingsstrategier som maximerar kvaliteten och styrkan hos den avvikande signalen, liksom fullständigheten hos de avvikande data som samlas in. Provabsorption är en begränsande faktor för experimenten, särskilt vid längsta våglängder. Absorptionskorrigeringar, som implementeras i vanliga MX-bearbetningsprogrampaket16,17, fungerar bra till våglängder runt 3 Å. Längre våglängder kommer att kräva analytiska absorptionskorrigeringar baserade på tomografiska rekonstruktioner18 eller laserablation för att avlägsna icke-diffracting material och skära kristallerna i väldefinierade former19. Den senare kommer också att bidra till att minska storleken på större kristaller eftersom röntgendiffraktionsexperiment vid längre våglängder är effektivare för mindre kristaller14. Utmaningen att hålla prover vid kryogena temperaturer under datainsamlingen hanteras genom ledande kylning, eftersom användning av kallgasströmsanordningar med öppet flöde inte är kompatibelt med en vakuummiljö. Därför behövs termiskt ledande material, såsom koppar, för att ansluta provet till en pulsrör cryocooler. De spine-standardstift i rostfritt stål som används i hela MX, liksom alla andra kommersiellt tillgängliga provfästen, är inte lämpliga för MX i vakuum med lång våglängd på grund av deras dåliga värmeledningsförmåga.
Provhållarna för MX i vakuum skall vara en väsentlig del av värmeavskigningsvägen (figur 3A). Som sådan består de av en termiskt ledande kopparkropp och stift och innehåller två viktiga funktioner: en stark magnetbas för att säkerställa en adekvat termisk länk till kall goniometerhuvudet och ett provfäste, tillverkat av polyimid, för att minimera röntgenabsorption och spridning20. Ansträngningar gjordes för att säkerställa att användarupplevelsen av kristallskörd och blixtkylning är nästan identisk med den som är förknippad med vanliga MX-metoder. Eftersom de dedikerade I23 SHs inte är direkt kompatibla med andra synkrotronbalkar används en adapter i rostfritt stål för kompatibilitet med kristallskördande magnetiska trollstavar och befintliga goniometergränssnitt på andra MX-strållinjer (figur 3B). Adaptern är också viktig för att använda automationsanläggningarna på andra Diamond MX-strållinjer, som är baserade på ALS-typ robotgriphuvuden21 och unipuck-stil baslayouter22, om provvariation kräver snabb förscreening för val av de bästa diffracting kristallerna. Provtagnings- och inläsningsprotokollet kan delas upp i två steg:
Steg 1: Skörd av kristaller och blixtfrysning som utförs av användare i sina egna laboratorier
Efter bedömning av projektets lämplighet för I23-datainsamling skickas provhållare med slingor som matchar kristallstorlekarna (förmonterade med adaptrar) till användarlaboratorier för kristallskörd. För att förhindra skador bör SHs och adaptrar inte separeras och ska användas som en enhet för fiskekristaller med öglor av lämplig storlek med hjälp av vanliga magnetiska trollstavar av kristallskörd. Som är vanligt i MX utförs denna uppgift manuellt under mikroskopet, och kristaller blixtkyls omedelbart i en skumdewar med flytande kväve23. På grund av en missmatchning av magnetiska krafter är SHs för närvarande inte kompatibla med unipucks. Lagring och frakt realiseras med hjälp av kombihål (se tabellen över material), som är tillgängliga för användare på begäran, tillsammans med de kompatibla torravlastarinsatserna (bild 3C). Dessa puckar delar samma basplatta med de allmänt använda unipucksna och möjliggör snabb förkontroll av prover vid andra Diamond MX-strållinjer. Att låna ut denna utrustning till användare är för närvarande det bästa arrangemanget, tills de skräddarsydda provinnehavarna är kommersiellt tillgängliga. Transport till strållinjen kräver de vanliga torravsändare som används i MX-samhället.
Steg 2: Överföring av kryokylda prover till vakuumstationen
När proverna anländer till strållinjen förbereds de för överföring till vakuumstationen. Detta innebär avlägsnande av SHs från kombihål och separation från adaptrar. Införandet av biologiska prover till vakuum utförs rutinmässigt inom kryoelektronmikroskopi. Några av de väletablerade koncepten anpassades för I23-provöverföringen. Kort sagt överförs SHs under flytande kväve till överföringsblock (figur 3D). Dessa block har utmärkt värmeledningsförmåga och en betydande termisk massa, vilket hindrar kristallerna från att nå glasövergångstemperaturen när de är i vakuum. Upp till fyra block, med en kapacitet på fyra prover vardera, lastas under flytande kväve i en blockpuck (figur 3H), som används antingen för överföring av prover till Kryogena överföringssystemet (CTS) eller för lagring i flytande kvävekrig mellan experiment.
Cryogenic Transfer System som utvecklats vid Diamond Light Source består av två underenheter, provstationen och skytteln (figur 4A). Provstationen består av ett flytande kvävebad för tillfällig lagring av proteinkristaller och har särskilda egenskaper för att garantera säkerheten och möjliggöra en användarvänlig upplevelse (figur 5). CTS styrs av en programmerbar logikstyrenhet via ett användarvänligt pekskärmsgränssnitt. Provstationen har lysdioder inbyggda för bättre visualisering och en uppsättning värmare som styrs i närbild för att automatisera torkningen av det flytande kvävebadet när proverna har överförts. Den har också en mängd olika sensorer för att säkerställa säkerhet och effektiv funktion av systemet. Provstationen har skräddarsydd hårdvara för att tillhandahålla ett tillförlitligt elektriskt gränssnitt för att interagera med skytteln för drift, såsom att pumpa ner till grovt vakuum för provöverföring, samt övervakning av flytande kvävenivåer och temperaturen inuti skytteln.
Shuttle (figur 6) är en bärbar enhet som används för att plocka upp ett överföringsblock från provstationens flytande kvävebad och överföra det i en kryogen och vakuummiljö till slutstationen. Den innehåller en flytande kvävedewar för att hålla proverna kalla under överföring, vätskenivåövervakning i dewar och en mängd olika sensorer för drift och användarsäkerhet. Överföringsarmen är utrustad med en magnetdrivning och innehåller bearbetade spår för att vägleda användare i säkert lastning och lossning av överföringsblock till ändstationen. Överföring från skytteln till vakuumkärlet sker via en luftsluss. Luftslussen är ett gränssnitt för skytteln på ändstationen som används för att evakuera utrymmet mellan skytteln och ändstationen, innan du öppnar pendel- och endstationsvakuumventilerna. Pump- och ventilationssekvenserna är helt automatiserade och kan styras via en stor pekskärm med ett användarvänligt gränssnitt (bild 4C). Det aktuella protokollet används för att överföra en thaumatinkristall till vakuumstationen för datainsamling.
Det nuvarande protokollet har utvecklats för att uppfylla kraven på provberedning för MX-experiment i vakuum med lång våglängd på strållinje I23. Den har använts på strållinjen under det senaste året och har bidragit till att flera projekt har slutförts framgångsrikt. Som framgår av resultaten som presenteras här möjliggör protokollet en säker och tillförlitlig överföring av prover till vakuumstationen samtidigt som deras diffraktionskvalitet bevaras. Det är en viktig aspekt för strållinjedriften och kommer att åtföljas av personlig användarutbildning av beamline-personal. Några av stegen är värda att lyftas fram som avgörande för ett framgångsrikt och säkert slutförande av förfarandet: överföring av prover från kombihålsbaser till provblock kräver noggrannhet och uppmärksamhet för att undvika skadliga prover (se steg 2.1.4). Övervakning av den flytande kvävenivån i alla led är viktig för att förhindra att prover exponeras för luft eller kommer i nära kontakt med delar som inte är ordentligt kylda (2.1.3 och 2.2.2). vänta tills stängningssekvensen (2.2.14) är helt klar innan du tar bort skytteln från ändstation (2.2.15), för att undvika nedbrytning av ändstationsvakuum.
Idén till protokollet inleddes tillsammans med en teknisk insats som syftade till att utveckla specialbyggd utrustning för överföring av proteinkristaller till vakuummiljön. De slutliga produkterna i detta projekt var CTS och tillhörande provhanteringsverktyg som beskrivs ovan. CTS är en betydande förbättring jämfört med föregångaren Leica EM VCT10014 och tar bort flera begränsningar, såsom bristen på provskärmning och vakuummiljö under överföring, isbildning inuti det flytande kvävebadet och avsaknaden av ett intuitivt användargränssnitt och säkerhetsfunktioner. Ytterligare funktioner i CTS som förbättrar användarupplevelsen är temperatur- och vätskekvävenivåövervakning inuti skyttel- och provstationen, ett badkar med större kapacitet som rymmer fyra kvarter samtidigt, snarare än ett, och en självstyrd mekanism för skytteloperationen. CTS är helt integrerat i strållinjestyrningssystemet med ett användarvänligt pekskärmsgränssnitt och förbättrad vakuum- och mekanisk säkerhet vid gränssnitt med endstationen.
Beamline I23 är det första MX-synkrotroninstrumentet med lång våglängd i sitt slag och som sådant introducerar proteinkristaller i en högvakuummiljö och lagrar dem vid kryogena temperaturer, har krävt betydande ansträngningar. Förbättringar av provberedningsverktygen och protokollen, samt insatser för att effektivisera processer, pågår. Som en del av användarsupporten finns strållinepersonal alltid tillgänglig för att hjälpa till med felsökning. Ett exempel på ett sådant scenario skulle vara problem som äventyrar vakuumsystemets integritet, vilket leder till svårigheter att fästa eller avlägsna skytteln till/från antingen CTS eller endstationsluftslussen. Olika testnivåer utförs varje vecka och dagligen, och användarutbildningen kommer att omfatta ytterligare kontroller för att undvika potentiella fel, som visuell inspektion av O-ringarna på gränssnitten som skytteln fäster vid. Medan vakuummiljön öppnar möjligheten att utföra diffraktionsexperiment i ett våglängdsområde som inte är tillgängligt vid andra strållinjer, minskar det ytterligare överföringssteget det totala provgenomströmningen.
Den manuella överföringen med endast fyra prover per överföringsblock och upp till fem block inuti vakuumkärlet begränsar den totala kapaciteten till 20 prover. För projekt med ett stort urval för att prova variabilitet bör prover därför förhandsgranskas vid Diamonds strålar med hög genomströmning, och då bör endast de mest lovande proverna överföras för det efterföljande optimerade långvåglängdsexperimentet. Även om provhållarna och överföringsblocken är oförändrade från den första introduktionen för några år sedan, är de hanteringsverktyg som presenteras här alla nya utvecklingar. De i23-hängivna provhållarna är oföränderliga på grund av sin roll i kylkonceptet för strållinjen. Som sådan syftade utformningen av provhanteringsverktygen till att skapa en länk mellan denna nya typ av hållare och standard kommersiellt tillgängliga verktyg som MX-användargemenskapen hade antagit under lång tid, såsom kombihål, kristallskördsstavar och transportsystemet för torravlastare. Deras design involverade betydande samråd med användargemenskapen och krävde flera iterationer för att slutföra. Utrustningen, verktygen och protokollet som presenteras här representerar ett enkelt och robust system för överföring av användarprover för experiment vid beamline I23 vid Diamond Light Source. Detta instrument för makromolekylär kristallografi i vakuum under lång våglängd öppnar nya möjligheter för strukturbiologi.
Vi vill tacka Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha och Kevin Wilkinson för deras stöd i utvecklingen av Kryogent provöverföringssystem (CTS). Detta arbete finansierades av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansierat av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program.
12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |