ניתוח הרכב השומנים של מיקובקטריה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה
Summary
פרוטוקול מוצג כדי לחלץ את התוכן השומנים הכולל של דופן התא של מגוון רחב של mycobacteria. יתר על כן, מיצוי ופרוטוקולים אנליטיים של סוגים שונים של חומצות מיקוליות מוצגים. פרוטוקול כרומטוגרפי בשכבה דקה לניטור תרכובות מיקובקטיות אלה מסופק גם כן.
Abstract
מינים Mycobacteria יכול להיות שונה זה מזה בקצב הצמיחה, נוכחות של פיגמנטציה, מורפולוגיה המושבה המוצגת על מדיה מוצקה, כמו גם מאפיינים פנוטיפיים אחרים. עם זאת, לכולם יש במשותף את האופי הרלוונטי ביותר של mycobacteria: דופן התא הייחודי והידרופובי מאוד שלה. מינים של מיקובקטריה מכילים קומפלקס מקושר-קוולנטי הכולל ערבינוגלקטן, פפטידוגליקן ושרשראות ארוכות של חומצות מיקוליות עם סוגים שונים בין מיני מיקובקטריה. בנוסף, mycobacteria יכול גם לייצר שומנים הממוקמים, שאינם קוולנטיים מקושרים, על משטחי התא שלהם, כגון פטיוצול dimycocerosates (PDIM), גליקולפידים פנוליים (PGL), גליקופפטידוליפידים (GPL), אציטרהאלוז (AT), או פוספטידיל-אינוזיטול mannosides (PIM), בין היתר. חלקם נחשבים גורמי ארס במיקובקטריה פתוגנית, או שומנים אנטיגניים קריטיים באינטראקציה בין מארח-מיקובקטריה. מסיבות אלה, יש עניין משמעותי בחקר השומנים mycobacterial בשל היישום שלהם במספר תחומים, מהבנת תפקידם בפתוגניות של זיהומים mycobacteria, למשמעות אפשרית כמו סוכנים אימונומודולטוריים לטיפול במחלות זיהומיות ופתולוגיות אחרות כגון סרטן. כאן, גישה פשוטה כדי לחלץ ולנתח את התוכן השומנים הכולל ואת הרכב חומצה mycolic של תאי mycobacteria גדל במדיום מוצק באמצעות תערובות של ממיסים אורגניים מוצג. לאחר תמציות השומנים מתקבלים, כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) מבוצעת כדי לפקח על תרכובות שחולצו. הניסוי לדוגמה מבוצע עם ארבעה מיקוביבקטריה שונים: Mycolicibacterium brumae ו- Mycolicibacterium fortuitum, Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) הגדלים במהירות: מיקובקטריום מורסה הגדל במהירות על ידי מיקוליצ’יבקטריום, המוכיח כי שיטות המוצגות בפרוטוקול הנוכחי יכולות לשמש למגוון רחב של מיקובקטריה.
Introduction
Mycobacterium הוא סוג הכולל מינים פתוגניים ולא פתוגניים, המאופיינת בקיר תא הידרופובי וחצוף מאוד שנוצר על ידי השומנים המוזרים שלהם. באופן ספציפי, דופן התא mycobacterial מכיל חומצות מיקוליות, אשר α-אלקיל וחומצות שומן הידרוקסיות β, שבהן הענף α קבוע בכל החומצות המיקוליות (למעט האורך) ושרשרת β, הנקראת שרשרת מרומיקולאט, היא שרשרת אליפטית ארוכה שעשויה להכיל קבוצות כימיות פונקציונליות שונות המתוארות יחד עם הספרות (α, α’-, מתוקסי-, κ-, אפוקסי-, קרבוקסי-, ו ω-1-מתוקסי- mycolates), ולכן לייצר שבעה סוגים של חומצות מיקוליות (I-VII)1. יתר על כן, שומנים אחרים עם חשיבות מוטלת בספק נמצאים גם בקיר התא של מינים mycobacteria. מינים פתוגניים כגון Mycobacterium tuberculosis, הסוכן הסיבתי של שחפת2 לייצר גורמי וירוליאנס ספציפיים מבוססי שומנים כגון פטיוצול דימיקוצריסטים (PDIMs), גליקוליפידים פנוליים (PGL), די,, תלת-, ופנטה-אציטרהאלוז (DAT, TAT ו- PAT), או סולגוליפידים, בין היתר3. נוכחותם על פני השטח המיקובקטריאליים נקשרה ליכולת לשנות את התגובה החיסונית המארחת ולכן, האבולוציה וההתמדה של המיקובקטריום בתוך הפונדקאי4. לדוגמה, נוכחות של triacylglycerols (TAG) קושרה פנוטיפ היפר-ויראלי של שושלת שושלת 2-בייג’ינג של M. tuberculosis, אולי בשל יכולתו להנחית את התגובה החיסונית המארחת5,6. שומנים רלוונטיים אחרים הם lipooligosaccharides (LOSs) נוכח מיקובקטריה שחפת ולאtuberculous. במקרה של Mycobacterium marinumנוכחותו של LOSs בקיר התא שלה קשורה תנועתיות הזזה ואת היכולת ליצור biofilms ומפריעה לזיהוי על ידי קולטני זיהוי דפוס מקרופאגים, המשפיעים על ספיגה וחיסול של החיידקים על ידי פאגוציטים מארחים7,8. בנוסף, היעדר או נוכחות של שומנים מסוימים מאפשרת לחברים מאותו המין להיות מסווגים למורפוטיפים שונים עם פרופילים אלימים או מוחלשים בעת אינטראקציה עם תאים מארחים. לדוגמה, היעדר גליקופפטידוליפידים (GPL) במורפוטיפ המחוספס של Mycobacterium abscessus נקשר ליכולת לגרום להחמצה תוך-פאגוזומלית, וכתוצאה מכך אפופטוזיס של תאים9שלא כמו מורפוטיפ חלק בעל GPLs על פני השטח שלהם., יתר על כן, התוכן השומנים של דופן התא mycobacterial קשורה ליכולת לשנות את התגובה החיסונית המארח. זה רלוונטי בהקשר של שימוש במיקובקטריה כלשהי כדי לעורר פרופיל חיסוני מגן מפני פתולוגיות שונות10,11,12,13. זה הוכח, למשל, כי Mycolicibacterium vaccaeמיקובקטריום ספרופיטי, הנמצא כעת בניסויים קליניים בשלב III כחיסון אימונותרפי לשחפת, מציג שני מורפוטיפים קולוניאליים., בעוד פנוטיפ חלק, המכיל פוליאסטר על פני השטח שלה, מפעיל תגובת Th2, פנוטיפ מחוספס נטול פוליאסטר יכול לגרום פרופיל Th1 כאשר הוא אינטראקציה עם תאים חיסוניים מארחים14. הרפרטואר של שומנים הנמצאים בתא mycobacterial לא רק תלוי מינים mycobacteria, אלא גם על התנאים של תרביות mycobacterial: זמן הדגירה15,16 או הרכב המדיום התרבותי17,18. למעשה, שינויים בהרכב המדיום התרבותי משפיעים על הפעילות האנטי-אטומית והאימונוסטימולטורית של M. bovis BCG ו Mycolicibacterium brumae in vitro17. יתר על כן, הפרופיל החיסוני המגן מופעל על ידי M. bovis BCG נגד M. tuberculosis האתגר במודלים של עכברים תלוי גם בתקשורת התרבותית שבה M. bovis BCG גדל17. אלה יכולים להיות קשורים להרכב השומנים של mycobacteria בכל מצב תרבית. מכל הסיבות הללו, המחקר של תוכן השומנים של mycobacteria רלוונטי. הליך חזותי כדי לחלץ ולנתח את הרכב השומנים של דופן התא mycobacterial מוצג.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול פשוט נחשב כשיטה תקן הזהב להפקת תרכובות שומנים שאינן מקושרות ללא קולן מקיר התא mycobacterial מוצג. הדמיה נוספת על ידי TLCs אחד דו מימדי מן השומנים שחולצו של ארבעה mycobacteria שונים מוצג.
שתי תערובות משולבות רצופות של כלורופורם ומתנול כדי לשחזר את התוכן השומנים של תאים mycobacterial הוא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי (RTI2018-098777-B-I00), קרנות FEDER, ואת הגנרליטאט של קטלוניה (2017SGR-229). סנדרה גולאר-גארידו היא זוכת חוזה לדוקטורט (FI) מהגנרליטאט דה קטלוניה.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
