Præsenteret her er en simpel protokol til rettet differentiering af hæmogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller i ca. 1 uge.
Blodkar er allestedsnærværende fordelt i alle væv i kroppen og udfører forskellige funktioner. Således er afledning af modne vaskulære endotelceller, der linjer blodkar lumen, fra humane pluripotente stamceller afgørende for en lang række vævsteknik og regenereringsapplikationer. In vivo er primordiale endotelceller afledt af den mesodermale afstamning og er specificeret mod specifikke undertyper, herunder arterielle, venøse, kapillæriske, hæmogene og lymfatiske. Hæmogene endotelceller er af særlig interesse, fordi de under udviklingen giver anledning til hæmatopoietiske stam- og stamceller, som derefter genererer alle blodlinjer gennem hele livet. Oprettelse af et system til generering af hæmogene endotelceller in vitro ville således give mulighed for at studere endotel-til-hæmatopoietisk overgang og kan føre til ex vivo-produktion af humane blodprodukter og reduceret afhængighed af humane donorer. Mens der findes flere protokoller til afledning af stamceller og primordiale endotelceller, er generering af velkarakteriserede hæmogene endotelceller fra humane stamceller ikke blevet beskrevet. Her præsenteres en metode til afledning af hæmogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uge: en differentieringsprotokol med primitive streakceller dannet som reaktion på GSK3β-hæmmer (CHIR99021), derefter mesoderm-afstamningsinduktion medieret af bFGF, efterfulgt af primordial endotelcelleudvikling fremmet af BMP4 og VEGF-A og endelig hæmogen endotelcellespecifikation induceret af retinsyre. Denne protokol giver en veldefineret population af hæmogene endotelceller, der kan bruges til yderligere at forstå deres molekylære regulering og endotel-til-hæmatopoietisk overgang, som har potentialet til at blive anvendt til downstream terapeutiske anvendelser.
Endotelceller (EC’er) er en heterogen population af celler, der udfører flere funktioner i hele menneskekroppen og i manipulerede væv. Ud over at understøtte og regulere andre celletyper (dvs. kardiomyocytter1, osteoblastiske celler2) omfatter disse funktioner dannelse af en selektiv barriere mellem blod og væv og hjælp til vævsdannelse3. Differentiering af modne EC’er under normal udvikling kræver forskellige signalveje. Primordial EC’er er afledt af mesoderm forfædre og specificeres derefter mod modne arterielle, venøse, kapillære og lymfatiske fænotyper4. Derudover er en lille delmængde af EC’er i den ekstraembryonale æggeblomme sac og embryonale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) region også specificeret til at blive hæmogene EC’er, som giver anledning til hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er), der migrerer til fosterleveren og føtal knoglemarv, hvor de forbliver postnatalt og genererer alle blodcelletyper gennem hele livet4. Den mangfoldige vifte af EF-fænotyper er afgørende for al vævsudvikling og vedligeholdelse.
EC’er og deres derivater er således kritiske komponenter i undersøgelser, der sigter mod modellering og belysning af mekanismer for menneskelig udvikling og / eller sygdom samt regenerativ medicin og vævstekniske applikationer 5,6,7,8. Den største begrænsning for denne type undersøgelser er imidlertid manglen på tilgængelighed af primære humane EC’er i den krævede mængde. Det anslås, at der vil være behov for mindst 3 x 108 EC’er til de fleste terapeutiske anvendelser6. For at løse dette problem er brugen af humane embryonale stamceller (hESC’er) og humaninducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) blevet foreslået på grund af deres forskellige afstamningspotentiale og deres evne til at generere et stort antal afkom 6,9.
Faktisk er anvendeligheden af celler afledt af hESC’er eller hiPSC’er blevet demonstreret i flere undersøgelser med fokus på sygdomsmodellering og lægemiddelscreening10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) teknologi er blevet brugt til mere trofast at rekapitulere fysiologien i den menneskelige krop ved at integrere celler og væv i tredimensionelle stilladser. Desuden kan tilslutning af flere individuelle OOC’er (en såkaldt body- eller human-on-a-chip, BOC/HOC) opnås via mikrofluidik for at muliggøre krydstale mellem organerneaf interesse 13,14,15. Understøttende væv, såsom vaskulaturen, er kritiske komponenter i OOC’er og BOC / HOC’er; Inkorporering af vaskulatur muliggør transport af næringsstoffer, ilt og parakrine faktorer gennem vævene og derved fremmer det nødvendige vævsspecifikke mikromiljø 3,12. Således er metoder til udledning af modne humane EC’er, såsom arterielle, venøse, lymfatiske og hæmogene EC’er, afgørende for at fremme disse vævstekniske tilgange.
Der er offentliggjort flere protokoller, der beskriver trin til afledning af menneskelige ur- eller stamfader-EC’er fra hESC’er eller hiPSC’er 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Mange af disse protokoller er afhængige af embryoid body (EB) dannelse eller co-kultur af ESC’er / iPSC’er med et murinføderlag af stromale celler. Disse strategier har tendens til at være vanskelige og tidskrævende med lave EF-udbytter og / eller forurening af humane EC’er med murinceller. Protokoller, der udelukkende er afhængige af 2D-kultur uden brug af stromale celler, kræver ofte lange induktioner, anvender komplekse kombinationer af vækstfaktorer og / eller hæmmere til induktion, har længere ekspansionsperioder efter celleseparation eller en kombination af disse faktorer. Øget viden om signalveje og faktorer, der er involveret i afledning af modne EF-typer in vivo, danner grundlaget for en enkel og robust in vitro-differentieringsprotokol.
Tidligere blev nøgleroller for Notch og Retinoic Acid (RA) signalveje i specifikationen af henholdsvis murine arterielle og hæmogene EC’er under udvikling identificeret. Notch-signalvejen spiller flere roller i specifikationen og vedligeholdelsen af den arterielle EC-fænotype. Arbejde ved hjælp af murine retinal vaskulariseringsmodel identificerede en vej, hvor væskeforskydningsspænding inducerer en Notch-Cx37-p27 signalakse, der fremmer G1-cellecyklusstop, hvilket muliggør arteriel EC-specifikation27. Cellecyklustilstande er blevet antaget at spille en rolle i celleskæbnebeslutninger ved at give forskellige muligheder, hvor celler er modtagelige for visse signaler, der kan inducere genekspression og fænotypiske ændringer28. Denne Notch-medierede G1-anholdelse muliggjorde ekspression af gener beriget i arterielle EC’er, herunder ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 og Notch 4 (gennemgået i29,30). Det har også vist sig, at hæmogen EF-specifikation fremmes in vivo via RA-signalering31,32. Yderligere undersøgelser identificerede, at nedstrøms for RA-signalering, ekspression af c-Kit og Notch opregulerer p27, hvilket muliggør hæmogen specifikation i murine æggeblommesækken og AGM33. Murine hæmogene EC’er kan minimalt identificeres ved ekspression af både endotel (dvs. CD31, KDR) og hæmatopoietiske (dvs. c-Kit, CD34) markører4. Endelig gennemgår hæmogene EC’er en endotel-til-hæmatopoietisk overgang (EHT) til dannelse af HSPC’er, som kan give anledning til alle blodcelletyper 4,34,35.
Nyligt arbejde testede, om det samme signalhierarki kan fremme menneskelig hæmogen EF-specifikation. For at gøre dette blev der udviklet en serum- og feederfri 2D-kulturprotokol til at udlede hæmogene EC’er fra hESC’er, og disse hæmogene EC’er blev karakteriseret på et enkelt celleniveau som CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45–. Denne undersøgelse udnyttede også FUCCI-reporteren (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), som identificerer forskellige cellecyklustilstande ved hjælp af H9-hESC’er, der udtrykker FUCCI-reporterkonstruktionen (H9-FUCCI-hESC)36. I undersøgelser med disse celler blev det påvist, at RA fremmer tidlig G1-cellecyklusstop i EC’er, og tidlig G1-tilstand muliggør hæmogen specifikation in vitro37. Heri gives en detaljeret protokol til differentiering af disse humane hæmogene endotelceller og assays, der bekræfter deres identitet. Denne enkle metode giver et nyttigt middel til at generere denne specialiserede delmængde af EC’er til fremtidige undersøgelser af mekanismer for udvikling af humane blodlegemer.
Heri skitseres trinene til fremstilling af hæmogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uge ved hjælp af et murinfoder- og serumfrit 2D-kultursystem (figur 1). Denne protokol udvider en metode beskrevet af Sriram et al. (2015) for at opnå primordial ECs38. CD31+ CD45-EC’ernes oprindelige karakter og specifikationspotentiale demonstreres ved at dyrke disse celler på DLL4-belagte plader og observere ændringer i genekspress…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH-tilskud HL128064 og U2EB017103. Yderligere støtte blev ydet af CT Innovations 15-RMB-YALE-04 tilskud.
15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
Cell Detatchment Solution Brand Name: vAccutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 mg/cm2 |
GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |