정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로
Summary
여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.
Abstract
뮤린 폐 조직의 시각화는 기본 기도 및 혈관에 관한 귀중한 구조 및 세포 정보를 제공합니다. 그러나, 진정으로 생리 조건을 나타내는 폐 혈관의 보존은 여전히 도전을 제시한다. 또한, 뮤린 폐의 섬세한 구성은 세포 구성과 아키텍처를 모두 보존하는 고품질 이미지에 대한 샘플을 준비하는 기술적 과제를 초래합니다. 유사하게, 세포 수축성 검사는 체외에서혈관 수축에 반응하는 세포의 잠재력을 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다, 그러나 이 소약은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 기술적 문제와는 달리, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS) 방법은 지역적 편견 없이 폐 조직을 3차원으로 시각화하고 최대 10일 동안 살아있는 대리 수축 모델로 작용할 수 있는 효율적인 대안으로 적용될 수 있다. PCLS를 사용하여 제조된 조직은 구조와 공간 방향을 보존하여 질병 과정을연구하는 것이 이상적입니다. 유도성 tdTomato 리포터 뮤린 모델에서 수확한 PCLS내 내인성 tdTomato 표지 세포의 위치는 공초점 현미경 검사법에 의해 성공적으로 시각화될 수 있다. 혈관 수축에 노출 된 후, PCLS는 시간 경과 모듈에 의해 포착 될 수있는 혈관 수축과 폐 구조 모두의 보존을 보여줍니다. 서부 블롯 및 RNA 분석과 같은 다른 절차와 함께 PCLS는 다양한 장애의 근간을 겪고 폐 혈관 질환의 병리생리학에 대한 더 나은 이해로 이어지는 신호 캐스케이드의 포괄적 인 이해에 기여할 수 있습니다.
Introduction
해부학 구조를 희생하지 않고 세포 구성 요소를 보존하는 폐 조직의 준비 및 이미징의 발전은 폐 질환에 대한 상세한 이해를 제공합니다. 생리구조를 유지하면서 단백질, RNA 및 기타 생물학적 화합물을 식별하는 능력은 수많은 폐 질환에서 병리학의 이해를 넓힐 수 있는 세포의 공간 적 배치에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이 상세한 심상은 폐 동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 질병의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다, 동물 모형에 적용될 때, 잠재적으로 향상한 치료 전략으로 이끌어 냅니다.
기술의 진보에도 불구하고, 뮤린 폐 조직의 고품질 이미지를 얻는 것은 여전히 도전남아있다. 호흡 주기는 흡입1도중 생성된 음성 내측 압력에 의해 구동됩니다. 전통적으로 생검을 얻고 화상 진찰을 위한 폐 견본을 준비하는 때, 음성 압력 그라데이션은 기도와 혈관의 붕괴의 결과로 손실됩니다, 이는 더 이상 현재 상태에서 자신을 나타내지 않습니다. 현재 상태를 반영하는 사실적인 이미지를 얻으려면 폐기도를 다시 팽창해야 하며, 혈관이 침투하여 동적 폐를 정적 설비로 변경해야 합니다. 이러한 뚜렷한 기술의 적용은 대식세포와 같은 면역 세포를 포함하여 구조적 무결성, 폐 혈관 및 세포 성분을 보존할 수 있게 하여 폐 조직이 가능한 한 생리적 상태에 가깝게 볼 수 있게 합니다.
정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 폐 혈관2의해부학 및 생리학을 연구하기위한 이상적인 도구입니다. PCLS는 구조 및 세포 성분을 보존하면서 폐 조직의 상세한 이미징을 3차원으로 제공합니다. PCLS는 동물 및 인간 모델에서 3차원으로 세포 기능의 생생, 고해상도 이미지를 허용하여 잠재적인 치료 목표를 연구하고, 작은 기도 수축을 측정하고, COPD, ILD 및 폐암3과같은 만성 폐 질환의 병리생리학을 연구하는 이상적인 도구입니다. 유사한 기술을 사용하여, 혈관 수축에 PCLS 견본의 노출은 폐 구조물 및 혈관 수축을 보존할 수 있습니다, 체외 조건에서 복제. 수축을 보존하는 것과 함께, 준비된 견본은 정확하게 준비될 때 RNA 시퀀싱, 서양 얼룩 및 유혈 세포측정과 같은 추가 분석을 겪을 수 있습니다. 마지막으로, 폐 수확 후 tdTomato 형광으로 표시된 리포터 색 표시 세포는 마이크로 슬라이스를 준비한 후 라벨을 보존할 수 있어 세포 추적 연구에 이상적입니다. 이러한 기술의 통합은 폐 혈관 질환에서 신호 캐스케이드 및 잠재적 치료 옵션에 대한 보다 상세한 이해로 이어질 수있는 세포 및 혈관 수축의 공간 배열을 보존하는 정교한 모델을 제공합니다.
이 원고에서 PCLS 뮤린 폐 조직은 혈관 수축에 노출되어 보존된 구조적 무결성과 혈관 수축을 입증합니다. 연구 결과는 적당히 준비되고 취급된 조직이 10 일 동안 실행 가능한 남아 있다는 것을 보여줍니다. 이 연구는 또한 내인성 형광(tdTomato)을 가진 세포의 보존을 보여 주며, 샘플이 폐 혈관 및 건축의 고해상도 이미지를 제공할 수 있도록 합니다. 마지막으로, RNA 측정및 근본적인 기계장치를 조사하기 위하여 서쪽 얼룩을 위한 조직 조각을 취급하고 준비하는 쪽이 기술되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 원고에서, 혈관 구조를 보존하고 실험적 유연성을 최적화하는 뮤린 폐 조직의 고해상도 이미지를 생성하는 향상된 방법이 설명되고, 특히 PCLS의 적용을 사용하여 혈관의 수축도 보존된 3차원에서 볼 수 있는 폐 조직의 미세 슬라이스를 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 생존 가능성 시약을 사용하여 신중하게 준비되고 보존된 슬라이스가 1주일 이상 생존력을 유지할 수 있음을 보여줍니다. 마이크?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 위안하오 박사와 카이펑 리우 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 1R01 HL150106-01A1, 파커 B. 프랜시스 펠로우십, 그리고 폐 고혈압 협회 Aldrighetti 연구 상 박사 케위안에 의해 지원되었다.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
