Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri
Summary
Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.
Abstract
Murine akciğer dokusunun görselleştirilmesi, alttaki hava yolu ve vaskülat ile ilgili değerli yapısal ve hücresel bilgiler sağlar. Bununla birlikte, fizyolojik koşulları gerçekten temsil eden pulmoner damarların korunması hala zorluklar ortaya koyuyor. Ek olarak, murine akciğerlerinin hassas konfigürasyonu, hem hücresel kompozisyonu hem de mimariyi koruyan yüksek kaliteli görüntüler için numuneler hazırlamakta teknik zorluklarla sonuçlanır. Benzer şekilde, hücresel kontritite tahlilleri, hücrelerin vazokonstriktörlere in vitroyanıt verme potansiyelini incelemek için yapılabilir, ancak bu tahliller sağlam akciğerin karmaşık ortamını yeniden üretmez. Bu teknik konuların aksine hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS) yöntemi, akciğer dokusunu bölgesel önyargı olmadan üç boyutlu olarak görselleştirmek için etkili bir alternatif olarak uygulanabilir ve 10 güne kadar canlı vekil kontritite modeli olarak hizmet vermektedir. PCLS kullanılarak hazırlanan doku, yapıyı ve mekansal yönelimi korumuştur, bu da hastalık süreçlerinin eks vivoincelenmesini ideal hale getirir. Endojen tdTomato etiketli hücrelerin, indüklenebilir bir tdTomato muhabir murine modelinden elde edilen PCLS’deki konumu konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirilebilir. Vazokonstriktörlere maruz kalındıktan sonra PCLS, hem damar kontrititesinin hem de zaman atlamalı bir modül tarafından yakalanabilen akciğer yapısının korunmasını gösterir. Batı blot ve RNA analizi gibi diğer prosedürlerle birlikte PCLS, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Introduction
Anatomik yapıdan ödün vermeden hücresel bileşenleri koruyan akciğer dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesinde meydana gelen gelişmeler pulmoner hastalıkların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Fizyolojik yapıyı korurken proteinleri, RNA’yı ve diğer biyolojik bileşikleri tanımlama yeteneği, çok sayıda pulmoner hastalıkta patofizyolojinin anlaşılmasını genişletebilecek hücrelerin mekansal düzeni hakkında hayati bilgiler sunar. Bu ayrıntılı görüntüler, hayvan modellerine uygulandığında pulmoner arter hipertansiyonu gibi pulmoner vasküler hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir ve potansiyel olarak iyileştirilmiş terapötik stratejilere yol açabilir.
Teknolojideki gelişmelere rağmen, murine akciğer dokusunun yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek zor olmaya devam ediyor. Solunum döngüsü, inhalasyon sırasında oluşan negatif intratorasik basınç tarafından tahrik edilir1. Geleneksel olarak biyopsiler elde edilirken ve akciğer örnekleri görüntüleme için hazırlanırken, negatif basınç gradyanı kaybolur ve bu da artık mevcut durumunda kendini temsil eden hava yolu ve vaskülatın çökmesine neden olabilir. Mevcut koşulları yansıtan gerçekçi görüntüler elde etmek için, pulmoner hava yolları yeniden şişirilmeli ve vaskülat perfüzyona maruz kalarak dinamik akciğeri statik bir fikstüre dönüştürmelidir. Bu farklı tekniklerin uygulanması, makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere yapısal bütünlüğün, pulmoner vaskülatın ve hücresel bileşenlerin korunmasına izin vererek akciğer dokusunun fizyolojik durumuna mümkün olduğunca yakın görülmesini sağlar.
Hassas kesim akciğer dilimleme (PCLS), pulmoner vaskülat2anatomisini ve fizyolojisini incelemek için ideal bir araçtır. PCLS, yapısal ve hücresel bileşenleri korurken akciğer dokusunun üç boyutlu olarak ayrıntılı görüntülenmesini sağlar. PCLS, hayvan ve insan modellerinde hücresel fonksiyonların canlı, yüksek çözünürlüklü görüntülerinin üç boyutta kullanılmasına izin vermek için kullanılmıştır, bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek, küçük hava yolu kasılmalarını ölçmek ve KOAH, ILD ve akciğer kanseri gibi kronik akciğer hastalıklarının patofizyolojisini incelemek için ideal biraraçtır 3. Benzer teknikler kullanılarak, PCLS örneklerinin vazokonstriktörlere maruz kalması akciğer yapısını ve damar kontrititesini koruyarak in vitro durumları çoğaltabilir. Sözleşmenin korunmasının yanı sıra, hazırlanan numuneler doğru hazırlandığında RNA dizilimi, Batı lekesi ve akış sitometrisi gibi ek analizlerden geçirilebilir. Son olarak, akciğer hasadından sonra tdTomato floresan ile işaretlenmiş muhabir renk etiketli hücreler, mikroslikler hazırladıktan sonra etiketlemeyi koruyabilir ve bu da hücre izleme çalışmaları için idealdir. Bu tekniklerin entegrasyonu, pulmoner vaskülür hastalığında sinyal basamaklarının ve potansiyel terapötik seçeneklerin daha ayrıntılı anlaşılmasına yol açabilecek hücrelerin mekansal düzenini ve damar kontrtinazlığını koruyan sofistike bir model sağlar.
Bu yazıda PCLS murine akciğer dokusu vasokonstriktörlere maruz kalarak korunmuş yapısal bütünlük ve damar kontrititesini ortaya koymuştur. Çalışma, uygun şekilde hazırlanan ve ele alınabilen dokunun 10 gün boyunca canlı kalabileceğini göstermektedir. Çalışma ayrıca endojen floresan (tdTomato) ile hücrelerin korunmasını göstererek, örneklerin pulmoner vaskülat ve mimarinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamasına izin vermektedir. Son olarak, doku dilimlerini RNA ölçümü için ve Batı lekesini alttaki mekanizmaları araştırmak için ele almanın ve hazırlamanın yolları açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, özellikle vasküler yapının korunmuş kontrititesi ile üç boyutlu olarak görülebilen akciğer dokusunun mikrosliklerini elde etmek için PCLS uygulaması kullanılarak, vasküler yapıyı koruyan ve deneysel esnekliği optimize eden yüksek çözünürlüklü murine akciğer dokusu görüntüleri üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmıştır. Uygulanabilirlik reaktifini kullanarak, protokol özenle hazırlanmış ve korunmuş dilimlerin bir haftadan fazla yaşayabilirliği koruyabilece?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Teknik destekleri için Dr. Yuan Hao ve Kaifeng Liu’ya teşekkür eder. Bu çalışma NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Bursu ve Dr. Ke Yuan’a Pulmoner Hipertansiyon Derneği Aldrighetti Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
