Presenteras här är ett protokoll för att bevara vaskulär kontraktiliteten av PCLS murine lung vävnad, vilket resulterar i en sofistikerad tredimensionell bild av pulmonell vaskulatur och luftvägarna, som kan bevaras i upp till 10 dagar som är mottagliga för många förfaranden.
Visualisering av murine lungvävnad ger värdefull strukturell och cellulär information om underliggande luftvägarna och vaskulatur. Bevarandet av lungkärl som verkligen representerar fysiologiska förhållanden innebär dock fortfarande utmaningar. Dessutom resulterar den känsliga konfigurationen av murin lungor i tekniska utmaningar att förbereda prover för högkvalitativa bilder som bevarar både cellulär sammansättning och arkitektur. På samma sätt kan cellulära kontraktilitetsanalyser utföras för att studera cellernas potential att svara på vasoconstrictors in vitro, men dessa analyser reproducerar inte den komplexa miljön i den intakta lungan. I motsats till dessa tekniska problem kan precisionsskuren lungskiva (PCLS) användas som ett effektivt alternativ för att visualisera lungvävnad i tre dimensioner utan regional partiskhet och fungera som en levande surrogatkontraktilitetsmodell i upp till 10 dagar. Vävnad som framställs med PCLS har bevarat struktur och rumslig orientering, vilket gör det idealiskt att studera sjukdomsprocesser ex vivo. Placeringen av endogena tdTomato-märkta celler i PCLS skördas från en inducible tdTomato reporter murine modell kan framgångsrikt visualiseras av confocal mikroskopi. Efter exponering för vasoconstrictors visar PCLS bevarandet av både fartygets kontraktilitet och lungstruktur, som kan fångas upp av en tidsfördröjningsmodul. I kombination med andra procedurer, såsom western blot och RNA-analys, kan PCLS bidra till den omfattande förståelsen av signalkaskader som ligger till grund för en mängd olika sjukdomar och leda till en bättre förståelse för patofysiologin vid lungvaskulära sjukdomar.
Framsteg i beredning och avbildning av lungvävnad som bevarar cellulära komponenter utan att offra anatomisk struktur ger en detaljerad förståelse av lungsjukdomar. Förmågan att identifiera proteiner, RNA och andra biologiska föreningar samtidigt som fysiologisk struktur upprätthålls erbjuder viktig information om cellernas rumsliga arrangemang som kan bredda förståelsen av patofysiologin vid många lungsjukdomar. Dessa detaljerade bilder kan leda till en bättre förståelse av pulmonell vaskulär sjukdomar, såsom pulmonell gatan hypertoni, när tillämpas på djurmodeller, vilket potentiellt leder till förbättrade terapeutiska strategier.
Trots tekniska framsteg är det fortfarande en utmaning att få högkvalitativa bilder av murin lungvävnad. Andningscykeln drivs av ett negativt intratroriskt tryck som genereras vid inandning1. När man traditionellt erhåller tarmbiopsier och förbereder lungprover för avbildning går den negativa tryckgradienten förlorad vilket resulterar i att luftvägarna och vaskulaturen kollapsar, vilket inte längre representerar sig självt i sitt nuvarande tillstånd. För att uppnå realistiska bilder som återspeglar nuvarande förhållanden måste lung luftvägarna återfvämmas och vaskulaturen perfunderas, ändra den dynamiska lungan till en statisk fixtur. Tillämpningen av dessa distinkta tekniker gör det möjligt att bevara strukturell integritet, lungvaskulatur och cellulära komponenter, inklusive immunceller som makrofager, så att lungvävnad kan ses så nära sitt fysiologiska tillstånd som möjligt.
Precisionsskuren lungslicing (PCLS) är ett idealiskt verktyg för att studera anatomin och fysiologin hos lungvaskulatur2. PCLS ger detaljerad avbildning av lungvävnaden i tre dimensioner samtidigt som strukturella och cellulära komponenter bevaras. PCLS har använts i djur- och mänskliga modeller för att möjliggöra levande, högupplösta bilder av cellulära funktioner i tre dimensioner, vilket gör det till ett idealiskt verktyg för att studera potentiella terapeutiska mål, mäta liten luftvägskontraktion och studera patofysiologi av kroniska lungsjukdomar som KOL, ILD och lungcancer3. Med hjälp av liknande tekniker kan exponeringen av PCLS-prover för vasoconstrictors bevara lungstruktur och kärlkontraktilitet, replikera in vitro-förhållanden. Tillsammans med att bevara kontraktilitet kan beredda prover genomgå ytterligare analys som RNA-sekvensering, västerländsk blot och flödescytometri när de bereds korrekt. Slutligen kan reporter färgmärkta celler märkta med tdTomato fluorescence efter lungskörd bevara märkning efter att ha förberett mikroslices, vilket gör den idealisk för cellspårningsstudier. Integrationen av dessa tekniker ger en sofistikerad modell bevara det rumsliga arrangemanget av celler och fartyg contractility som kan leda till en mer detaljerad förståelse av signalering kaskader och potentiella terapeutiska alternativ i pulmonell vaskulatur sjukdom.
I detta manuskript utsätts PCLS murin lungvävnad för vasoconstrictors, vilket visar bevarad strukturell integritet och fartyg kontraktilitet. Studien visar att den vävnad som beretts och hanteras på lämpligt sätt kan förbli livskraftig i 10 dagar. Studien visar också bevarandet av celler med endogen fluorescens (tdTomato), vilket gör det möjligt för prover att ge högupplösta bilder av lungvaskulaturen och arkitekturen. Slutligen har sätt att hantera och förbereda vävnadsskivor för RNA-mätning och western blot för att undersöka underliggande mekanismer beskrivits.
I detta manuskript beskrivs en förbättrad metod för att producera högupplösta bilder av murin lungvävnad som bevarar kärlstrukturen och optimerar experimentell flexibilitet, särskilt med hjälp av PCLS för att erhålla mikroslices av lungvävnad som kan ses i tre dimensioner med bevarad kontraktilitet av vaskulaturen. Med hjälp av reagenset visar protokollet att noggrant förberedda och konserverade skivor kan behålla livskraften i mer än en vecka. Bevarad livskraft hos mikroslices gör det möjligt för fler…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Drs. Yuan Hao och Kaifeng Liu för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship och Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award till Dr. Ke Yuan.
0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
30cc syringe | BD | 309650 | |
Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
Confocal | Zeiss | 880 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
Mortar and Pestle | Amazon | ||
RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |