Precision Cut Lung Slices som et effektivt værktøj til Ex vivo Pulmonal Vessel Structure og Contractility Studies

Summary

Præsenteret her er en protokol til bevarelse af vaskulær kontraktilitet AF PCLS murin lungevæv, hvilket resulterer i en sofistikeret tre-dimensionelle billede af lunge vasulatur og luftveje, som kan bevares i op til 10 dage, der er modtagelige for mange procedurer.

Abstract

Visualiseringen af murin lungevæv giver værdifulde strukturelle og cellulære oplysninger om de underliggende luftveje og vaskulatur. Men bevarelsen af lungekar, der virkelig repræsenterer fysiologiske forhold, giver stadig udfordringer. Derudover resulterer den delikate konfiguration af murin lunger i tekniske udfordringer med at forberede prøver til billeder af høj kvalitet, der bevarer både cellulær sammensætning og arkitektur. Tilsvarende cellulære kontraktilitet assays kan udføres for at studere potentialet i celler til at reagere på vasoconstrictors in vitro, men disse analyser ikke gengive det komplekse miljø af den intakte lunge. I modsætning til disse tekniske problemer, præcision-cut lunge skive (PCLS) metode kan anvendes som et effektivt alternativ til at visualisere lungevæv i tre dimensioner uden regional bias og tjene som en levende surrogat kontraktilitet model i op til 10 dage. Væv fremstillet ved hjælp af PCLS har bevaret struktur og rumlig orientering, hvilket gør det ideelt at studere sygdomsprocesser ex vivo. Placeringen af endogene tdTomato-mærkede celler i PCLS høstet fra en inucible tdTomato reporter murine model kan med succes visualiseres ved konfokal mikroskopi. Efter eksponering for vasoconstrictors demonstrerer PCLS bevarelsen af både fartøjskontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges af et time-lapse-modul. I kombination med de andre procedurer, såsom western blot og RNA-analyse, kan PCLS bidrage til den omfattende forståelse af signaleringskaskader, der ligger til grund for en bred vifte af lidelser og fører til en bedre forståelse af patofysiologien i lungesygdomme.

Introduction

Fremskridt i forberedelsen og billeddannelsen af lungevæv, der bevarer cellulære komponenter uden at ofre anatomisk struktur, giver en detaljeret forståelse af lungesygdomme. Evnen til at identificere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser og samtidig opretholde fysiologisk struktur giver vigtige oplysninger om det rumlige arrangement af celler, der kan udvide forståelsen af patofysiologien i mange lungesygdomme. Disse detaljerede billeder kan føre til en bedre forståelse af lungesygdomme, såsom lungepulsåren hypertension, når de anvendes på dyremodeller, potentielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.

På trods af teknologiske fremskridt er det fortsat en udfordring at få billeder af murin lungevæv af høj kvalitet. Åndedrætscyklussen er drevet af et negativt intrathoracisk tryk, der genereres under indånding¹. Når der traditionelt opnås biopsier og forbereder lungeprøver til billeddannelse, går negativtryksgradienten tabt, hvilket resulterer i sammenbruddet af luftvejene og vaskulaturen, som ikke længere repræsenterer sig selv i sin nuværende tilstand. For at opnå realistiske billeder, der afspejler de aktuelle forhold, skal lungeluftvejene genbøjes, og vaskulaturen gennemsyres, ændre den dynamiske lunge til en statisk armatur. Anvendelsen af disse forskellige teknikker gør det muligt at bevare strukturel integritet, lunge-vaskulatur, og cellulære komponenter, herunder immunceller såsom makrofager, så lungevæv, der skal ses så tæt på sin fysiologiske tilstand som muligt.

Præcision skåret lunge udskæring (PCLS) er et ideelt værktøj til at studere anatomi og fysiologi af lunge vasulatur². PCLS giver detaljeret billeddannelse af lungevævet i tre dimensioner, samtidig med at strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS er blevet brugt i dyre- og menneskelige modeller for at give mulighed for levende billeder i høj opløsning af cellulære funktioner i tre dimensioner, hvilket gør det til et ideelt værktøj til at studere potentielle terapeutiske mål, måle små luftvejssammentrækning og studere patofysiologien af kroniske lungesygdomme som KOL, ILS og lungekræft³. Ved hjælp af lignende teknikker kan eksponeringen af PCLS-prøver for vasoconstrictors bevare lungestruktur og fartøjskontraktilitet og replikere in vitro-forhold. Sammen med at bevare sammentrækning, forberedte prøver kan gennemgå yderligere analyse såsom RNA sekventering, Vestlige blot, og flow cytometri, når de fremstilles korrekt. Endelig kan reporter farvemærkede celler markeret med tdTomato fluorescens efter lungehøst bevare mærkning efter fremstilling af mikroslices, hvilket gør den ideel til cellesporingsundersøgelser. Integrationen af disse teknikker giver en sofistikeret model, der bevarer den rumlige placering af celler og fartøjskontraktilitet, der kan føre til en mere detaljeret forståelse af signalkaskader og potentielle terapeutiske muligheder i lunge vaskulatursygdom.

I dette manuskript udsættes PCLS murine lungevæv for vasoconstrictors, der demonstrerer bevaret strukturel integritet og fartøjskontraktilitet. Undersøgelsen viser, at vævet, der fremstilles og håndteres korrekt, kan forblive levedygtigt i 10 dage. Undersøgelsen viser også bevarelsen af celler med endogen fluorescens (tdTomato), så prøver kan give billeder i høj opløsning af lungekarkulaturen og arkitekturen. Endelig er der beskrevet måder at håndtere og forberede vævsskiver til RNA-måling og western blot for at undersøge underliggende mekanismer.

Protocol

Al dyrepleje var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Boston Children’s Hospital og Institutional Animal Care and Use Committee godkendte protokoller. De mus, der anvendes i denne undersøgelse, er vilde type C57/B6-mus og Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato krydsede mus. 1. Udarbejdelse af løsninger Forbered fosfat buffer løsning (1x PBS) og 2% agarose løsning kræves under forsøget på forhånd. Bland 2 g agarosepulver i 100 mL autoklavet vand. Varm det i mikrobølgeovn…

Representative Results

Når det tilsættes til celler eller væv, ændres levedygtighedsreagenset ved at reducere miljøet af levedygtigt væv og bliver lyserødt / rødt og bliver meget fluorescerende. De repræsentative farveændringer, der registreres fra dag 0-1 og dag 9-10, er vist i figur 3. Som nævnt startede opløsningen blå og blev lyserød natten over, hvilket viser levedygtighed. Farveændring sker typisk inden for 1-4 timer. det kan dog være nødvendigt med længere tid. Til analyse for levedygtighe…

Discussion

I dette manuskript beskrives en forbedret metode til at producere billeder i høj opløsning af murin lungevæv, der bevarer den vaskulære struktur og optimerer eksperimentel fleksibilitet, specifikt ved hjælp af anvendelsen af PCLS for at opnå mikroslices af lungevæv, der kan ses i tre dimensioner med bevaret kontraktilitet af vaskulaturen. Ved hjælp af levedygtighedsreagenset viser protokollen, at omhyggeligt forberedte og konserverede skiver kan bevare levedygtigheden i mere end en uge. Mikroslices bevarede leved…

Materials

0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G