Precisie gesneden longplakken als een efficiënt hulpmiddel voor ex vivo longvatstructuur en contractiliteitsstudies
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het behoud van de vasculaire contractiliteit van PCLS-muizenlongweefsel, wat resulteert in een geavanceerd driedimensionaal beeld van de pulmonale vasculatuur en de luchtwegen, die tot 10 dagen kunnen worden bewaard en die vatbaar zijn voor tal van procedures.
Abstract
De visualisatie van murine longweefsel biedt waardevolle structurele en cellulaire informatie over de onderliggende luchtweg en vasculatuur. Het behoud van longvaten dat echt fysiologische omstandigheden vertegenwoordigt, brengt echter nog steeds uitdagingen met zich mee. Bovendien resulteert de delicate configuratie van muizenlongen in technische uitdagingen bij het voorbereiden van monsters voor beelden van hoge kwaliteit die zowel de cellulaire samenstelling als de architectuur behouden. Evenzo kunnen cellulaire contractiliteitstests worden uitgevoerd om het potentieel van cellen te bestuderen om in vitroop vasoconstrictoren te reageren , maar deze testen reproduceren niet de complexe omgeving van de intacte long. In tegenstelling tot deze technische problemen, kan de precisie-cut lung slice (PCLS) -methode worden toegepast als een efficiënt alternatief om longweefsel in drie dimensies te visualiseren zonder regionale vertekening en dienen als een live surrogaatcontractiliteitsmodel voor maximaal 10 dagen. Weefsel bereid met behulp van PCLS heeft een behouden structuur en ruimtelijke oriëntatie, waardoor het ideaal is om ziekteprocessen ex vivo te bestuderen. De locatie van endogene tdTomato-gelabelde cellen in PCLS geoogst uit een induceerbare tdTomato reporter murine model kan met succes worden gevisualiseerd door confocale microscopie. Na blootstelling aan vasoconstrictoren demonstreert PCLS het behoud van zowel vessel contractiliteit als longstructuur, die kan worden vastgelegd door een time-lapse module. In combinatie met de andere procedures, zoals western blot- en RNA-analyse, kan PCLS bijdragen aan het uitgebreide begrip van signaalcascades die ten grondslag liggen aan een breed scala aan aandoeningen en leiden tot een beter begrip van de pathofysiologie bij longvasculaire aandoeningen.
Introduction
Vooruitgang in de voorbereiding en beeldvorming van longweefsel dat cellulaire componenten behoudt zonder de anatomische structuur op te offeren, biedt een gedetailleerd inzicht in longziekten. Het vermogen om eiwitten, RNA en andere biologische verbindingen te identificeren met behoud van fysiologische structuur biedt essentiële informatie over de ruimtelijke ordening van cellen die het begrip van de pathofysiologie bij tal van longziekten kan verbreden. Deze gedetailleerde beelden kunnen leiden tot een beter begrip van pulmonale vaatziekten, zoals pulmonale arterie hypertensie, wanneer toegepast op diermodellen, wat mogelijk kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
Ondanks de technologische vooruitgang blijft het verkrijgen van hoogwaardige beelden van muizenlongweefsel een uitdaging. De ademhalingscyclus wordt aangedreven door een negatieve intrathoracale druk die wordt gegenereerd tijdens inademing1. Bij het traditioneel verkrijgen van biopsieën en het voorbereiden van longmonsters voor beeldvorming, gaat de negatieve drukgradiënt verloren, wat resulteert in de ineenstorting van de luchtweg en vasculatuur, die zichzelf niet langer in zijn huidige staat vertegenwoordigt. Om realistische beelden te krijgen die de huidige omstandigheden weerspiegelen, moeten de pulmonale luchtwegen opnieuw worden opgeblazen en de vasculatuur worden doordrenkt, waardoor de dynamische long in een statisch armatuur verandert. De toepassing van deze verschillende technieken maakt het behoud van structurele integriteit, pulmonale vasculatuur en cellulaire componenten mogelijk, inclusief immuuncellen zoals macrofagen, waardoor longweefsel zo dicht mogelijk bij zijn fysiologische toestand kan worden bekeken.
Precision cut lung slicing (PCLS) is een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van de anatomie en fysiologie van pulmonale vasculatuur2. PCLS biedt gedetailleerde beeldvorming van het longweefsel in drie dimensies met behoud van structurele en cellulaire componenten. PCLS is gebruikt in dier- en menselijke modellen om levende beelden met hoge resolutie van cellulaire functies in drie dimensies mogelijk te maken, waardoor het een ideaal hulpmiddel is om potentiële therapeutische doelen te bestuderen, kleine luchtwegcontractie te meten en de pathofysiologie van chronische longziekten zoals COPD, ILD en longkanker te bestuderen3. Met behulp van vergelijkbare technieken kan de blootstelling van PCLS-monsters aan vasoconstrictoren de longstructuur en vatcontractiliteit behouden, waardoor in vitro omstandigheden worden gerepliceert. Naast het behoud van contractiliteit, kunnen voorbereide monsters aanvullende analyses ondergaan, zoals RNA-sequencing, Western blot en flowcytometrie wanneer ze correct worden bereid. Ten slotte kunnen reporter kleur gelabelde cellen gemarkeerd met tdTomato-fluorescentie na longoogst de etikettering behouden na het bereiden van microslices, waardoor het ideaal is voor celvolgstudies. De integratie van deze technieken biedt een geavanceerd model met behoud van de ruimtelijke ordening van cellen en vatcontractiliteit die kan leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de signaalcascades en potentiële therapeutische opties bij pulmonale vasculatuurziekte.
In dit manuscript wordt PCLS-muizenlongweefsel blootgesteld aan vasoconstrictoren, wat een behouden structurele integriteit en vatcontractiliteit aantoont. De studie toont aan dat het weefsel dat op de juiste manier is voorbereid en behandeld, 10 dagen levensvatbaar kan blijven. De studie toont ook het behoud van cellen met endogene fluorescentie (tdTomato), waardoor monsters beelden met hoge resolutie van de pulmonale vasculatuur en architectuur kunnen leveren. Ten slotte zijn manieren beschreven om weefselplakken te hanteren en voor te bereiden voor RNA-meting en Western blot om onderliggende mechanismen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript wordt een verbeterde methode beschreven om hoge resolutie beelden van murien longweefsel te produceren die de vasculaire structuur behoudt en experimentele flexibiliteit optimaliseert, met name met behulp van de toepassing van PCLS om microslices van longweefsel te verkrijgen die in drie dimensies kunnen worden bekeken met behoud van contractiliteit van de vasculatuur. Met behulp van het levensvatbaarheidsreagens toont het protocol aan dat zorgvuldig bereide en bewaarde plakjes de levensvatbaarheid lang…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Drs. Yuan Hao en Kaifeng Liu bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een NIH 1R01 HL150106-01A1, de Parker B. Francis Fellowship en de Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award aan Dr. Ke Yuan.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
