Presisjonskuttede lungeskiver som et effektivt verktøy for Ex vivo lungefartøystruktur og kontraktilitetsstudier

Summary

Presentert her er en protokoll for å bevare vaskulær kontraktilitet av PCLS murin lungevev, noe som resulterer i et sofistikert tredimensjonalt bilde av lungevaskulaturen og luftveiene, som kan bevares i opptil 10 dager som er utsatt for mange prosedyrer.

Abstract

Visualiseringen av murin lungevev gir verdifull strukturell og cellulær informasjon om underliggende luftvei og vaskulatur. Bevaring av lungefartøy som virkelig representerer fysiologiske forhold gir imidlertid fortsatt utfordringer. I tillegg resulterer den delikate konfigurasjonen av murin lunger i tekniske utfordringer med å forberede prøver for bilder av høy kvalitet som bevarer både cellulær sammensetning og arkitektur. På samme måte kan cellulære kontraktilitetsanalyser utføres for å studere potensialet til celler for å reagere på vasokonstriktorer in vitro, men disse analysene reproduserer ikke det komplekse miljøet i den intakte lungen. I motsetning til disse tekniske problemene kan den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) brukes som et effektivt alternativ til å visualisere lungevev i tre dimensjoner uten regional skjevhet og tjene som en live surrogatkontraktilitetsmodell i opptil 10 dager. Vev tilberedt ved hjelp av PCLS har bevart struktur og romlig orientering, noe som gjør det ideelt å studere sykdomsprosesser ex vivo. Plasseringen av endogene tdTomato-merkede celler i PCLS høstet fra en induserbar tdTomato reporter murine modell kan vellykket visualiseres ved konfikal mikroskopi. Etter eksponering for vasokonstriktorer demonstrerer PCLS bevaring av både karkontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges opp av en tidsforløpmodul. I kombinasjon med de andre prosedyrene, som vestlig blot- og RNA-analyse, kan PCLS bidra til den omfattende forståelsen av signalkaskader som ligger til grunn for et bredt spekter av lidelser og fører til en bedre forståelse av patofysiologien i lungevaskulære sykdommer.

Introduction

Fremskritt i fremstilling og avbildning av lungevev som bevarer cellulære komponenter uten å ofre anatomisk struktur gir en detaljert forståelse av lungesykdommer. Evnen til å identifisere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser samtidig som man opprettholder fysiologisk struktur, gir viktig informasjon om det romlige arrangementet av celler som kan utvide forståelsen av patofysiologien i mange lungesykdommer. Disse detaljerte bildene kan føre til en bedre forståelse av lungevaskulære sykdommer, som pulmonal arterie hypertensjon, når de brukes på dyremodeller, noe som potensielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.

Til tross for fremskritt innen teknologi, er det fortsatt en utfordring å skaffe bilder av murin lungevev av høy kvalitet. Åndedrettssyklusen drives av et negativt intrathoracic trykk generert under innånding¹. Når du tradisjonelt skaffer biopsier og forbereder lungeprøver for avbildning, går den negative trykkgradienten tapt, noe som resulterer i sammenbrudd av luftveiene og vaskulaturen, som ikke lenger representerer seg selv i sin nåværende tilstand. For å oppnå realistiske bilder som reflekterer dagens forhold, må lungeveiene fylles opp igjen, og vaskulaturen perfunderes, og endrer den dynamiske lungen til en statisk armatur. Anvendelsen av disse distinkte teknikkene gjør det mulig å bevare strukturell integritet, lungevaskulatur og cellulære komponenter, inkludert immunceller som makrofager, slik at lungevev kan ses så nær sin fysiologiske tilstand som mulig.

Presisjonskuttet lungeslicing (PCLS) er et ideelt verktøy for å studere anatomien og fysiologien til lungevaskulatur². PCLS gir detaljert bildebehandling av lungevevet i tre dimensjoner samtidig som strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS har blitt brukt i dyre- og menneskelige modeller for å tillate levende bilder med høy oppløsning av cellulære funksjoner i tre dimensjoner, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å studere potensielle terapeutiske mål, måle liten luftveiskontraksjon og studere patofysiologien til kroniske lungesykdommer som KOLS, ILD og lungekreft³. Ved hjelp av lignende teknikker kan eksponeringen av PCLS-prøver til vasokonstriktorer bevare lungestruktur og karkontraktilitet, og gjenskape in vitro-forhold. Sammen med å bevare kontraktilitet, kan forberedte prøver gjennomgå ytterligere analyse som RNA-sekvensering, vestlig blotten og strømningscytometri når de er forberedt riktig. Til slutt kan reporterfargemerkede celler merket med tdTomato-fluorescens etter lungehøst bevare merking etter å ha forberedt mikroslikvier, noe som gjør den ideell for cellesporingsstudier. Integreringen av disse teknikkene gir en sofistikert modell som bevarer det romlige arrangementet av celler og karkontraktilitet som kan føre til en mer detaljert forståelse av signalkaskadene og potensielle terapeutiske alternativer ved lungevaskulatursykdom.

I dette manuskriptet er PCLS murin lungevev utsatt for vasokonstriktorer, som demonstrerer bevart strukturell integritet og karkontraktilitet. Studien viser at vevet som er tilberedt og håndtert på riktig måte, kan forbli levedyktig i 10 dager. Studien viser også bevaring av celler med endogen fluorescens (tdTomato), slik at prøver kan gi høyoppløselige bilder av lungevaskulaturen og arkitekturen. Til slutt er det beskrevet måter å håndtere og klargjøre vevsskiver for RNA-måling og vestlig flekk for å undersøke underliggende mekanismer.

Protocol

All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene fra Boston Children’s Hospital og Institutional Animal Care and Use Committee godkjente protokoller. Musene som brukes i denne studien er vill type C57 / B6 mus og Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato krysset mus. 1. Utarbeidelse av løsninger Forbered fosfatbufferløsning (1x PBS) og 2% agarose løsning som kreves under eksperimentet på forhånd. Bland 2 g agarosepulver i 100 ml autoklavert vann. Varm den opp i mikrobølgeovnen noen s…

Representative Results

Når det legges til celler eller vev, endres levedyktighetsreagenset ved å redusere miljøet av levedyktig vev og blir rosa / rødt, og blir svært fluorescerende. De representative fargeendringene som oppdages fra dag 0-1 og dag 9-10, vises i figur 3. Som nevnt startet løsningen blå og ble rosa over natten, noe som viste levedyktighet. Fargeendring skjer vanligvis innen 1-4 timer. Det kan imidlertid være nødvendig med lengre tid. For å analyse for levedyktighet ble en plateleser brukt…

Discussion

I dette manuskriptet beskrives en forbedret metode for å produsere høyoppløselige bilder av murin lungevev som bevarer den vaskulære strukturen og optimaliserer eksperimentell fleksibilitet, spesielt ved bruk av PCLS for å oppnå mikroslikvier av lungevev som kan ses i tre dimensjoner med bevart kontraktilitet av vaskulaturen. Ved hjelp av levedyktighetsreagensen viser protokollen at nøye forberedte og bevarte skiver kan beholde levedyktigheten i mer enn en uke. Bevart levedyktighet av mikroslikviene gjør det muli…

Materials

0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G