Precisionsskurna lungskivor som ett effektivt verktyg för ex vivo pulmonellkärlsstruktur och kontraktilitetsstudier
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att bevara vaskulär kontraktiliteten av PCLS murine lung vävnad, vilket resulterar i en sofistikerad tredimensionell bild av pulmonell vaskulatur och luftvägarna, som kan bevaras i upp till 10 dagar som är mottagliga för många förfaranden.
Abstract
Visualisering av murine lungvävnad ger värdefull strukturell och cellulär information om underliggande luftvägarna och vaskulatur. Bevarandet av lungkärl som verkligen representerar fysiologiska förhållanden innebär dock fortfarande utmaningar. Dessutom resulterar den känsliga konfigurationen av murin lungor i tekniska utmaningar att förbereda prover för högkvalitativa bilder som bevarar både cellulär sammansättning och arkitektur. På samma sätt kan cellulära kontraktilitetsanalyser utföras för att studera cellernas potential att svara på vasoconstrictors in vitro, men dessa analyser reproducerar inte den komplexa miljön i den intakta lungan. I motsats till dessa tekniska problem kan precisionsskuren lungskiva (PCLS) användas som ett effektivt alternativ för att visualisera lungvävnad i tre dimensioner utan regional partiskhet och fungera som en levande surrogatkontraktilitetsmodell i upp till 10 dagar. Vävnad som framställs med PCLS har bevarat struktur och rumslig orientering, vilket gör det idealiskt att studera sjukdomsprocesser ex vivo. Placeringen av endogena tdTomato-märkta celler i PCLS skördas från en inducible tdTomato reporter murine modell kan framgångsrikt visualiseras av confocal mikroskopi. Efter exponering för vasoconstrictors visar PCLS bevarandet av både fartygets kontraktilitet och lungstruktur, som kan fångas upp av en tidsfördröjningsmodul. I kombination med andra procedurer, såsom western blot och RNA-analys, kan PCLS bidra till den omfattande förståelsen av signalkaskader som ligger till grund för en mängd olika sjukdomar och leda till en bättre förståelse för patofysiologin vid lungvaskulära sjukdomar.
Introduction
Framsteg i beredning och avbildning av lungvävnad som bevarar cellulära komponenter utan att offra anatomisk struktur ger en detaljerad förståelse av lungsjukdomar. Förmågan att identifiera proteiner, RNA och andra biologiska föreningar samtidigt som fysiologisk struktur upprätthålls erbjuder viktig information om cellernas rumsliga arrangemang som kan bredda förståelsen av patofysiologin vid många lungsjukdomar. Dessa detaljerade bilder kan leda till en bättre förståelse av pulmonell vaskulär sjukdomar, såsom pulmonell gatan hypertoni, när tillämpas på djurmodeller, vilket potentiellt leder till förbättrade terapeutiska strategier.
Trots tekniska framsteg är det fortfarande en utmaning att få högkvalitativa bilder av murin lungvävnad. Andningscykeln drivs av ett negativt intratroriskt tryck som genereras vid inandning1. När man traditionellt erhåller tarmbiopsier och förbereder lungprover för avbildning går den negativa tryckgradienten förlorad vilket resulterar i att luftvägarna och vaskulaturen kollapsar, vilket inte längre representerar sig självt i sitt nuvarande tillstånd. För att uppnå realistiska bilder som återspeglar nuvarande förhållanden måste lung luftvägarna återfvämmas och vaskulaturen perfunderas, ändra den dynamiska lungan till en statisk fixtur. Tillämpningen av dessa distinkta tekniker gör det möjligt att bevara strukturell integritet, lungvaskulatur och cellulära komponenter, inklusive immunceller som makrofager, så att lungvävnad kan ses så nära sitt fysiologiska tillstånd som möjligt.
Precisionsskuren lungslicing (PCLS) är ett idealiskt verktyg för att studera anatomin och fysiologin hos lungvaskulatur2. PCLS ger detaljerad avbildning av lungvävnaden i tre dimensioner samtidigt som strukturella och cellulära komponenter bevaras. PCLS har använts i djur- och mänskliga modeller för att möjliggöra levande, högupplösta bilder av cellulära funktioner i tre dimensioner, vilket gör det till ett idealiskt verktyg för att studera potentiella terapeutiska mål, mäta liten luftvägskontraktion och studera patofysiologi av kroniska lungsjukdomar som KOL, ILD och lungcancer3. Med hjälp av liknande tekniker kan exponeringen av PCLS-prover för vasoconstrictors bevara lungstruktur och kärlkontraktilitet, replikera in vitro-förhållanden. Tillsammans med att bevara kontraktilitet kan beredda prover genomgå ytterligare analys som RNA-sekvensering, västerländsk blot och flödescytometri när de bereds korrekt. Slutligen kan reporter färgmärkta celler märkta med tdTomato fluorescence efter lungskörd bevara märkning efter att ha förberett mikroslices, vilket gör den idealisk för cellspårningsstudier. Integrationen av dessa tekniker ger en sofistikerad modell bevara det rumsliga arrangemanget av celler och fartyg contractility som kan leda till en mer detaljerad förståelse av signalering kaskader och potentiella terapeutiska alternativ i pulmonell vaskulatur sjukdom.
I detta manuskript utsätts PCLS murin lungvävnad för vasoconstrictors, vilket visar bevarad strukturell integritet och fartyg kontraktilitet. Studien visar att den vävnad som beretts och hanteras på lämpligt sätt kan förbli livskraftig i 10 dagar. Studien visar också bevarandet av celler med endogen fluorescens (tdTomato), vilket gör det möjligt för prover att ge högupplösta bilder av lungvaskulaturen och arkitekturen. Slutligen har sätt att hantera och förbereda vävnadsskivor för RNA-mätning och western blot för att undersöka underliggande mekanismer beskrivits.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript beskrivs en förbättrad metod för att producera högupplösta bilder av murin lungvävnad som bevarar kärlstrukturen och optimerar experimentell flexibilitet, särskilt med hjälp av PCLS för att erhålla mikroslices av lungvävnad som kan ses i tre dimensioner med bevarad kontraktilitet av vaskulaturen. Med hjälp av reagenset visar protokollet att noggrant förberedda och konserverade skivor kan behålla livskraften i mer än en vecka. Bevarad livskraft hos mikroslices gör det möjligt för fler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Drs. Yuan Hao och Kaifeng Liu för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship och Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award till Dr. Ke Yuan.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
