Protocole de dissection automatisé pour l’enrichissement des tumeurs dans les tissus à faible teneur tumorale

Summary

L’annotation numérique avec dissection tissulaire automatisée fournit une approche innovante pour enrichir la tumeur dans les cas à faible teneur tumorale et est adaptable aux types de paraffine et de tissus congelés. Le flux de travail décrit améliore la précision, la reproductibilité et le débit et pourrait être appliqué à la fois à la recherche et aux milieux cliniques.

Abstract

L’enrichissement tumoral dans les tissus à faible teneur tumorale, ceux dont la teneur en tumeurs est inférieure à 20% selon la méthode, est nécessaire pour générer des données de qualité reproductibles avec de nombreux tests en aval tels que le séquençage de nouvelle génération. La dissection tissulaire automatisée est une nouvelle méthodologie qui automatise et améliore l’enrichissement des tumeurs dans ces tissus communs à faible teneur tumorale en diminuant l’imprécision dépendante de l’utilisateur de la macro-dissection traditionnelle et les limites de temps, de coût et d’expertise de la microdissection de capture laser en utilisant une superposition d’annotation d’image numérique sur des diapositives non colorées. Ici, les annotations numériques d’hématoxyline et d’éosine (H & E) sont utilisées pour cibler de petites zones tumorales à l’aide d’une lame de²⁵⁰ μm 2 de diamètre dans des sections de paraffine fixes non colorées (FFPE) ou de sections fraîches congelées jusqu’à 20 μm d’épaisseur pour un enrichissement tumoral automatisé avant l’extraction des acides nucléiques et le séquençage de l’exome entier (WES). La dissection automatisée peut récolter des régions annotées dans des tissus à faible teneur tumorale à partir d’une ou de plusieurs sections pour l’extraction d’acides nucléiques. Il permet également de capturer des mesures de collecte étendues avant et après la récolte tout en améliorant la précision, la reproductibilité et en augmentant le débit avec l’utilisation de moins de diapositives. Le protocole décrit permet l’annotation numérique avec dissection automatisée sur des FFPE animaux et/ou humains ou des tissus frais congelés à faible teneur en tumeurs et pourrait également être utilisé pour tout enrichissement de région d’intérêt afin de renforcer l’adéquation pour les applications de séquençage en aval dans les flux de travail cliniques ou de recherche.

Introduction

Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est de plus en plus utilisé à la fois pour les soins aux patients et dans la recherche sur le cancer afin d’aider à orienter les traitements et à faciliter les découvertes scientifiques. Les tissus sont souvent limités et de petits échantillons à teneur tumorale variable sont couramment utilisés. L’adéquation et l’intégrité des tumeurs restent donc un obstacle à l’obtention de données significatives. Les échantillons avec des pourcentages tumoraux plus faibles peuvent avoir de la difficulté à distinguer les vraies variantes des artefacts de séquençage et sont souvent inéligibles pour NGS¹. Il a été démontré que l’enrichissement tumoral des cas à faible teneur tumorale, ceux inférieurs à 20%, aide à produire suffisamment de matériel pour générer des données de séquençage reproductibles et garantir que les variantes à basse fréquence ne sont pas manquées ^2,3. Cependant, les limites varieront en fonction des plates-formes utilisées et de l’utilisation prévue des données générées.

Traditionnellement, l’enrichissement des régions tumorales pour l’extraction est effectué par macrodissection manuelle ou microdissection par capture laser (LCM) de lames de formol incorporées dans de la paraffine fixe (FFPE). La macrodissection manuelle, ou le grattage de zones tissulaires spécifiées à partir de lames, permet d’enlever les régions tumorales pour les utiliser dans des essais en aval à un coût relativement faible, mais avec une faible précision et une faible précision ^2,4. Une précision technique minimale peut être très efficace avec des cas de contenu tumoral plus élevé où de grandes étendues de tumeur sont présentes et / ou une perte tissulaire minimale n’a pas d’impact significatif sur les résultats, mais les cas à faible teneur tumorale ou les cas avec une tumeur plus dispersée nécessitent une précision accrue. Le LCM a donc été inventé dans les années 1990 et est devenu un moyen précieux d’éliminer avec précision les petites régions microscopiques de tissu définies des lames de formol incorporées dans la paraffine fixe (FFPE) ^5,6,7,8. La LCM peut être utilisée pour collecter des populations unicellulaires lorsqu’il existe une hétérogénéité complexe de l’échantillon⁹ permettant la collecte de populations cellulaires auparavant difficiles à séparer. Cependant, LCM nécessite des machines coûteuses qui nécessitent une expertise technique approfondie et un temps pratique 10,11,12,13,14.

L’instrument utilisé pour la dissection tissulaire automatisée a une précision comprise entre celle du LCM (~10 μm) et des macrodissections (~1 mm)¹⁵. En outre, il présente à la fois des exigences de coût et d’expertise technique entre celle de la macrodissection et de la LCM et est conçu pour effectuer un enrichissement rapide des tissus à partir de lames FFPE séquentielles afin d’atténuer les inconvénients des méthodes précédentes¹⁵. La dissection automatisée de cette manière utilise des annotations numériques ou des superpositions d’images de référence de diapositives sur scène sur des lames de tissu non colorées sectionnées en série pour disséquer et enrichir les régions d’intérêt. L’instrument utilise des pointes de fraisage à lame filante en plastique, des tubes de collecte de 1,5 mL et peut être utilisé avec un certain nombre de fluides différents pour la dissection afin de collecter les régions d’intérêt pour les essais en aval, y compris l’extraction et le séquençage nucléiques. La pointe de fraisage en plastique en filature utilise des réservoirs de baril de seringue intérieurs et extérieurs et un piston pour collecter le tampon, puis fraise et collecte le tissu¹⁶. Le diamètre variable de la pointe de fraisage (250 μm, 525 μm, 725 μm) peut permettre la dissection de zones tissulaires séparées à des fins de comparaison, de régions multifocales pouvant être regroupées ou de petites zones individuelles à partir de lames FFPE simples ou multiples. Les épaisseurs de section utilisées pour la récolte peuvent être ajustées en fonction des besoins individuels de l’expérience et les utilisateurs peuvent s’assurer que les régions d’intérêt n’ont pas été épuisées en effectuant un H & E supplémentaire sur une section en série immédiatement après la dernière section utilisée pour la récolte.

La dissection automatisée a été identifiée comme un moyen d’enrichir le contenu tumoral dans les cas à faible teneur tumorale et nous avons testé et étendu la fonctionnalité prévue d’un instrument de dissection tissulaire automatisé, qui est actuellement commercialisé pour une utilisation sur des échantillons cliniques FFPE jusqu’à 10 μm d’épaisseur. Les travaux montrent que la dissection automatisée peut être appliquée à la fois aux FFPE et aux coupes de tissus humains ou animaux fraîchement congelés jusqu’à 20 μm d’épaisseur à des fins de recherche. Le protocole démontre également une approche pour annoter numériquement et automatiser la dissection pour l’enrichissement de la tumeur dans les tissus à faible teneur tumorale et / ou les cas avec une tumeur imbriquée et dispersée où une macrodissection significative est difficile ou impossible et montre à la fois la qualité et le rendement de l’acide nucléique suffisant pour le NGS. La dissection automatisée peut donc fournir une précision de niveau intermédiaire et un débit accru pour l’enrichissement des tumeurs et pourrait également être appliquée pour enrichir d’autres régions d’intérêt ou combinée avec d’autres plates-formes pour répondre à des questions de recherche ou cliniques.

Protocol

Avant l’initiation, obtenir les échantillons de tissus appropriés conformément aux protocoles du Comité d’examen institutionnel (CISR). Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Genentech, Inc. 1. Préparation des tissus et des lames Sélectionnez FFPE ou blocs de tissus frais congelés et utilisez la méthode de traitement correspondante ci-dessous. Coupez des sections d…

Representative Results

Des coupes hépatiques de souris FFPE et FF contenant un cancer colorectal métastatique dans des xénogreffes ont été sélectionnées. Les sections ont été colorées H & E (Figure 1A, E, I) et numérisées sur un imageur de diapositives entières à un grossissement de 20x. Un pathologiste a annoté numériquement les régions tumorales d’intérêt et un masque a été généré à l’aide d’un logiciel commercial et formaté comme une image de référence png num?…

Discussion

Présenté ici est un protocole pour l’application de l’annotation numérique et de la dissection automatisée pour disséquer les régions tumorales à partir de FFPE à faible teneur tumorale ou de tissus frais congelés pour l’enrichissement et l’utilisation de la tumeur dans WES. La combinaison de l’annotation numérique et de la création de masques avec la dissection automatisée réduit considérablement le temps pratique et l’expertise requis communs aux méthodes classiques d’enrichissement des tum…

Materials

Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214