Protocollo di dissezione automatizzato per l'arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale
Summary
L’annotazione digitale con dissezione tissutale automatizzata fornisce un approccio innovativo all’arricchimento del tumore nei casi a basso contenuto tumorale ed è adattabile sia alla paraffina che ai tipi di tessuto congelato. Il flusso di lavoro descritto migliora l’accuratezza, la riproducibilità e la produttività e potrebbe essere applicato sia alla ricerca che alle impostazioni cliniche.
Abstract
L’arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale, quelli al di sotto del 20% del contenuto tumorale a seconda del metodo, è necessario per generare dati di qualità riproducibili con molti saggi a valle come il sequenziamento di prossima generazione. La dissezione tissutale automatizzata è una nuova metodologia che automatizza e migliora l’arricchimento tumorale in questi tessuti comuni a basso contenuto tumorale diminuendo l’imprecisione dipendente dall’utente della macro-dissezione tradizionale e le limitazioni di tempo, costi e competenze della microdissezione di acquisizione laser utilizzando la sovrapposizione di annotazioni di immagini digitali su vetrini non macchiati. Qui, le annotazioni digitali di ematossilina ed eosina (H & E) vengono utilizzate per colpire piccole aree tumorali utilizzando una lama di 250 μm2 di diametro in paraffina fissa di formalina non macchiata incorporata (FFPE) o sezioni fresche congelate fino a 20 μm di spessore per l’arricchimento automatico del tumore prima dell’estrazione dell’acido nucleico e del sequenziamento dell’intero esoma (WES). La dissezione automatizzata può raccogliere regioni annotate in tessuti a basso contenuto tumorale da sezioni singole o multiple per l’estrazione di acidi nucleici. Consente inoltre di acquisire ampie metriche di raccolta pre e post-raccolta, migliorando al contempo l’accuratezza, la riproducibilità e l’aumento della produttività con l’utilizzo di un minor numero di diapositive. Il protocollo descritto consente l’annotazione digitale con dissezione automatizzata su FFPE animale e/o umano o tessuti freschi congelati a basso contenuto tumorale e potrebbe anche essere utilizzato per qualsiasi arricchimento della regione di interesse per aumentare l’adeguatezza per le applicazioni di sequenziamento a valle nei flussi di lavoro clinici o di ricerca.
Introduction
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è sempre più utilizzato sia per la cura del paziente che nella ricerca sul cancro per aiutare a guidare i trattamenti e facilitare la scoperta scientifica. Il tessuto è spesso limitato e piccoli campioni con contenuto tumorale variabile vengono utilizzati di routine. L’adeguatezza e l’integrità del tumore, quindi, rimangono una barriera per ottenere dati significativi. I campioni con percentuali tumorali più basse possono causare difficoltà nel distinguere le varianti reali dagli artefatti di sequenziamento e spesso non sono idonei per NGS1. L’arricchimento tumorale dei casi a basso contenuto tumorale, quelli inferiori al 20%, ha dimostrato di aiutare a produrre materiale sufficiente per generare dati di sequenziamento riproducibili e garantire che le varianti a bassa frequenza non vengano perse 2,3. Tuttavia, i limiti varieranno a seconda delle piattaforme utilizzate e dell’uso pianificato dei dati generati.
Tradizionalmente, l’arricchimento delle regioni tumorali per l’estrazione viene eseguito mediante macrodissezione manuale o microdissezione a cattura laser (LCM) di vetrini incorporati a paraffina fissa di formalina (FFPE). La macrodissezione manuale, o raschiatura di aree di tessuto specifiche dai vetrini, consente di rimuovere le regioni tumorali per l’uso in saggi a valle con un costo relativamente basso, ma con bassa accuratezza e bassa precisione 2,4. L’accuratezza tecnica minima può essere molto efficace con casi con un contenuto tumorale più elevato in cui sono presenti ampie fasce di tumore e / o una minima perdita di tessuto non influisce in modo significativo sui risultati, ma i casi a basso contenuto di tumore o i casi con tumore più disperso richiedono una maggiore precisione. LCM è stato quindi inventato nel 1990 ed è diventato un modo prezioso per rimuovere con precisione piccole, definite, microscopiche regioni di tessuto dalla formalina paraffina fissa incorporata (FFPE) vetrini 5,6,7,8. LCM può essere utilizzato per raccogliere popolazioni di singole cellule quando esiste un’eterogeneità complessa del campione9 che consente la raccolta di popolazioni cellulari precedentemente difficili da separare. Tuttavia, LCM richiede macchinari costosi che richiedono una vasta esperienza tecnica e un tempo pratico 10,11,12,13,14.
Lo strumento utilizzato per la dissezione tissutale automatizzata ha una precisione compresa tra quella di LCM (~10 μm) e macrodissezioni (~1 mm)15. Inoltre, presenta requisiti di costo e competenza tecnica tra quello della macrodissezione e LCM ed è progettato per eseguire un rapido arricchimento tissutale da vetrini FFPE sequenziali per alleviare gli svantaggi dei metodi precedenti15. La dissezione automatizzata in questo modo utilizza annotazioni digitali o sovrapposizioni di immagini di riferimento di diapositive sul palco su vetrini di tessuto non macchiati sezionati in serie per sezionare e arricchire le regioni di interesse. Lo strumento utilizza punte di fresatura a lama di filatura in plastica, tubi di raccolta da 1,5 ml e può essere utilizzato con una serie di fluidi diversi per la dissezione per raccogliere regioni di interesse per saggi a valle tra cui l’estrazione nucleica e il sequenziamento. La punta di fresatura in plastica rotante utilizza serbatoi interni ed esterni della canna della siringa e uno stantuffo per raccogliere il tampone, quindi fresa e raccoglie il tessuto16. Il diametro variabile della punta di fresatura (250 μm, 525 μm, 725 μm) può consentire la dissezione di aree tissutali separate per il confronto, regioni multifocali che possono essere raggruppate o singole piccole aree da diapositive FFPE singole o multiple. Gli spessori delle sezioni utilizzati per la raccolta possono essere regolati in base alle esigenze individuali dell’esperimento e gli utenti possono garantire che le regioni di interesse non siano state esaurite eseguendo un H&E aggiuntivo su una sezione seriale immediatamente dopo l’ultima sezione utilizzata per la raccolta.
La dissezione automatizzata è stata identificata come un modo per arricchire il contenuto tumorale nei casi a basso contenuto tumorale e abbiamo testato e ampliato la funzionalità prevista di uno strumento di dissezione tissutale automatizzato, che è attualmente commercializzato per l’uso su campioni clinici FFPE fino a 10 μm di spessore. Il lavoro mostra che la dissezione automatizzata può essere applicata sia a FFPE che a sezioni di tessuto umano o animale congelato fresco fino a 20 μm di spessore per scopi di ricerca. Il protocollo dimostra anche un approccio per annotare e automatizzare digitalmente la dissezione per l’arricchimento tumorale in tessuti a basso contenuto tumorale e / o casi con tumore nidificato e disperso in cui una macrodissezione significativa è impegnativa o non fattibile e mostra sia la qualità che la resa dell’acido nucleico sufficiente per NGS. La dissezione automatizzata può quindi fornire una precisione di medio livello e una maggiore produttività per l’arricchimento del tumore e potrebbe anche essere applicata per arricchire altre regioni di interesse o combinata con altre piattaforme per rispondere a domande di ricerca o cliniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene presentato un protocollo per l’applicazione dell’annotazione digitale e della dissezione automatizzata per sezionare regioni tumorali da FFPE a basso contenuto tumorale o tessuti freschi congelati per l’arricchimento tumorale e l’uso in WES. La combinazione di annotazioni digitali e creazione di maschere con la dissezione automatizzata riduce significativamente il tempo pratico richiesto e le competenze comuni ai metodi classici di arricchimento tumorale, tra cui la macrodissezione manuale e LCM. Il protocollo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Carmina Espiritu e Robin E. Taylor per il loro supporto nello sviluppo della dissezione automatizzata e lo staff del Genentech Pathology Core Laboratory che ha supportato questo lavoro.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
