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생물학

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D2O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Abstract

Pour ralentir et prévenir la propagation des infections résistantes aux antimicrobiens, il est urgent de procéder à des tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour déterminer quantitativement les effets antimicrobiens sur les agents pathogènes. Il faut généralement des jours pour compléter l’AST par des méthodes conventionnelles basées sur la culture à long terme, et elles ne fonctionnent pas directement pour les échantillons cliniques. Ici, nous rapportons une méthode AST rapide rendue possible par l’imagerie par diffusion Raman stimulée (SRS) de l’incorporation métabolique d’oxyde de deutérium (D2O). L’incorporation métabolique deD2Odans la biomasse et l’inhibition de l’activité métabolique lors de l’exposition aux antibiotiques au niveau de la bactérie unique sont surveillées par imagerie SRS. La concentration d’inactivation du métabolisme unicellulaire (SC-MIC) des bactéries lors de l’exposition aux antibiotiques peut être obtenue après un total de 2,5 heures de préparation et de détection des échantillons. De plus, cette méthode AST rapide est directement applicable aux échantillons bactériens dans des environnements biologiques complexes, tels que l’urine ou le sang total. L’imagerie métabolique SRS de l’incorporation de deutérium est transformatrice pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Introduction

La résistance aux antimicrobiens (RAM) est une menace mondiale croissante pour le traitement efficace des maladies infectieuses1. On prévoit que la RAM causera 10 millions de décès supplémentaires par an et une perte de PIB mondial de 100 000 milliards de dollars d’ici 2050 si aucune mesure n’est prise pour lutter contre les bactéries résistantes auxantibiotiques1,2. Cela souligne le besoin urgent de méthodes de diagnostic rapides et innovantes pour les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) des bactéries infectieuses afin de ralentir l’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques et de réduire le taux de mortalité associé3. Pour assurer le meilleur résultat clinique possible, il est crucial d’introduire un traitement efficace dans les 24 heures. Cependant, la méthode de référence actuelle, comme la méthode de diffusion sur disque ou de dilution du bouillon, nécessite généralement au moins 24 heures pour la procédure de préincubation des échantillons cliniques et 16 à 24 heures supplémentaires pour obtenir les résultats de la concentration minimale inhibitrice (CMI). Dans l’ensemble, ces méthodes prennent trop de temps pour guider une décision immédiate pour le traitement des maladies infectieuses en clinique, ce qui conduit à l’émergence et à la propagation de la résistance aux antimicrobiens4.

Des méthodes AST génotypiques, telles que les techniques basées sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR)5, ont été développées pour une détection rapide. Ces techniques mesurent les séquences génétiques de résistance spécifiques afin de fournir des résultats AST rapides. Ils ne dépendent pas de la culture cellulaire qui prend beaucoup de temps; Cependant, seules des séquences génétiques spécifiques connues avec résistance sont testées. Par conséquent, son application est limitée à diverses espèces bactériennes ou à différents mécanismes de résistance. De plus, ils ne peuvent pas fournir de résultats de CMI pour les décisions thérapeutiques 6,7. En outre, de nouvelles méthodes phénotypiques pour l’AST rapide sont en cours de développement pour surmonter ces limitations8, y compris les dispositifs microfluidiques 9,10,11,12,13, les dispositifs optiques14,15,16, l’AST phénotypique quantifiant les acides nucléiques numéro de copie17,18, et les méthodes spectroscopiques Raman 19, 20,21,22,23,24. Ces méthodes réduisent le temps nécessaire pour guider les résultats de l’AST, mais la plupart d’entre elles ne s’appliquent qu’aux isolats bactériens, et non directement aux échantillons cliniques, et nécessitent toujours une préincubation prolongée.

Dans ce travail, nous présentons une méthode de détermination rapide de la sensibilité des bactéries dans l’urine et le sang total via le suivi de l’activité métabolique cellulaire par imagerie SRS. L’eau (H2O) participe à la grande majorité des processus essentiels de synthèse biomoléculaire dans les cellules vivantes. En tant qu’isotopologue de l’eau, par réaction d’échange H/D catalysée par enzyme entre l’atome d’hydrogène redox-actif dans le NADPH et l’atome D dansD2O, le deutérium peut être incorporé dans la biomasse à l’intérieur d’une cellule25,26. Une réaction de synthèse d’acides gras deutérés est médiée par le deutérium marqué NADPH. L’incorporation deD2Odans les réactions des acides aminés (AA) entraîne la production de protéines deutérées26 (Figure 1). De cette façon, les biomolécules nouvellement synthétisées contenant des liaisons C-D dans des cellules microbiennes simples peuvent être utilisées comme marqueur d’activité métabolique générale à détecter. Pour lire les liaisons C-D synthétisées de novo, la spectroscopie Raman, un outil analytique polyvalent fournissant des informations chimiques spécifiques et quantitatives sur les biomolécules, est largement utilisée pour déterminer la sensibilité aux antimicrobiens et réduire considérablement le temps de test à quelques heures27,28,29,30 . Cependant, en raison de la faible efficacité inhérente au processus de diffusion Raman, la spectroscopie Raman spontanée est de faible sensibilité de détection. Par conséquent, il est difficile d’obtenir des résultats d’image en temps réel en utilisant la spectroscopie Raman spontanée. La diffusion Raman cohérente (CRS), y compris la diffusion Raman cohérente anti-Stokes (CARS) et la diffusion Raman stimulée (SRS), a atteint une sensibilité de détection élevée en raison du champ lumineux cohérent pour générer des ordres de grandeur plus grands que celui de la spectroscopie Raman spontanée, rendant ainsi l’imagerie chimique à grande vitesse, spécifique et quantitative au niveau de la cellule unique 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Ici, sur la base de nos travaux les plus récents40, nous présentons un protocole pour la détermination rapide de l’activité métabolique et de la sensibilité aux antimicrobiens par imagerie femtoseconde SRS C-D de l’incorporation de bactéries D2O dans le milieu normal, l’urine et l’environnement sanguin total au niveau unicellulaire. L’imagerie femtoseconde SRS facilite la surveillance de la concentration d’inactivation du métabolisme unicellulaire (SC-MIC) contre les antibiotiques au niveau de la bactérie unique en 2,5 heures. Les résultats SC-MIC sont validés par test MIC standard par microdilution du bouillon. Notre méthode est applicable pour déterminer la sensibilité aux antimicrobiens des bactéries pathogènes des infections des voies urinaires (IVU) et des infections sanguines (BSI) avec un temps de test beaucoup plus court par rapport à la méthode conventionnelle, ce qui ouvre la possibilité d’une AST phénotypique rapide en clinique au niveau unicellulaire.

Protocol

L’utilisation d’échantillons de sang humain est conforme aux directives de l’IRB de l’Université de Boston et des National Institutes of Health (NIH). Plus précisément, les spécimens proviennent d’une banque et sont complètement dépersonnalisés. Ces spécimens ne sont pas considérés comme des sujets humains par le bureau du comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université de Boston. 1. Préparation de la solution mère de bactéries et d’antibiotiques …

Representative Results

L’effet du temps d’incubation sur l’incorporation du deutérium est mesuré par microspectroscopie Raman spontanée dans les régions C-D (2070 à 2250 cm-1) et C-H (2 800 à 3 100 cm-1) (Figure 4a). Les spectres Raman monocellulaires en accéléré de P. aeruginosa cultivés dans un milieu contenant du D2O à 70 % montrent une augmentation de l’intensité CD/CH sur le temps d’incubation de 0 à 180 min. (Figure 4b) L’a…

Discussion

L’AST rapide peut être obtenue en évaluant la réponse de l’activité métabolique bactérienne au traitement antibiotique à l’aide de l’imagerie métabolique SRS unicellulaire dans les 2,5 heures suivant l’échantillon aux résultats SC-MIC. La réponse de l’activité métabolique bactérienne et la sensibilité aux antimicrobiens peuvent être détectées en surveillant l’incorporation métabolique de D2O pour la synthèse de biomolécules à l’aide de l’imagerie SRS des liaisons C-D. É…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par NIH R01AI141439 à J.-X.C et M.S, et R35GM136223 à J.-X.C.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
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References

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
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