Denne protokollen presenterer rask antimikrobiell følsomhetstesting (AST) analyse innen 2,5 timer ved enkeltcellestimulert Raman-spredningsavbildning av D2O-metabolisme. Denne metoden gjelder bakterier i urin- eller fullblodsmiljøet, som er transformativ for rask encellet fenotypisk AST i klinikken.
For å bremse og forhindre spredning av antimikrobielle resistente infeksjoner, er rask antimikrobiell følsomhetstesting (AST) i akutt behov for å kvantitativt bestemme antimikrobielle effekter på patogener. Det tar vanligvis dager å fullføre AST ved konvensjonelle metoder basert på langtidskulturen, og de fungerer ikke direkte for kliniske prøver. Her rapporterer vi en rask AST-metode aktivert ved stimulert Raman-spredning (SRS) avbildning av deuteriumoksid (D2O) metabolsk inkorporering. Metabolsk inkorporering av D2O i biomasse og metabolsk aktivitetshemming ved eksponering for antibiotika på enkeltbakterienivå overvåkes av SRS-avbildning. Enkeltcellemetabolismens inaktiveringskonsentrasjon (SC-MIC) av bakterier ved eksponering for antibiotika kan oppnås etter totalt 2,5 timer med prøvepreparering og deteksjon. Videre er denne raske AST-metoden direkte anvendelig for bakterieprøver i komplekse biologiske miljøer, som urin eller fullblod. SRS metabolsk avbildning av deuteriuminkorporering er transformativ for rask encellet fenotypisk AST i klinikken.
Antibiotikaresistens (AMR) er en økende global trussel mot effektiv behandling av smittsomme sykdommer1. Det er spådd at AMR vil forårsake ytterligere 10 millioner dødsfall per år og $ 100 billioner globalt BNP-tap innen 2050 hvis detikke iverksettes tiltak for å bekjempe antibiotikaresistente bakterier 1,2. Dette understreker det presserende behovet for raske og innovative diagnostiske metoder for antibiotikafølsomhetstesting (AST) av smittsomme bakterier for å bremse fremveksten av antibiotikaresistente bakterier og redusere den relaterte dødeligheten3. For å sikre best mulig klinisk resultat er det avgjørende å innføre effektiv behandling innen 24 timer. Imidlertid krever den nåværende gullstandardmetoden, som diskdiffusjon eller buljongfortynningsmetode, vanligvis minst 24 timer for preinkubasjonsprosedyren for kliniske prøver og ytterligere 16-24 timer for å oppnå resultatene av minimal hemmende konsentrasjon (MIC). Samlet sett er disse metodene for tidkrevende til å veilede en umiddelbar beslutning om infeksjonssykdomsbehandling i klinikken, noe som fører til fremvekst og spredning av antimikrobiell resistens4.
Genotypiske AST-metoder, som polymerasekjedereaksjon (PCR)-baserte teknikker5, er utviklet for rask deteksjon. Slike teknikker måler de spesifikke resistensgenetiske sekvensene for å gi raske AST-resultater. De er ikke avhengige av tidkrevende cellekultur; Imidlertid testes bare spesifikke kjente genetiske sekvenser med resistens. Derfor er applikasjonen begrenset til forskjellige bakteriearter eller forskjellige resistensmekanismer. De kan heller ikke gi MIC-resultater for behandlingsbeslutninger 6,7. Dessuten er nye fenotypiske metoder for rask AST under utvikling for å overvinne disse begrensningene8, inkludert mikrofluidiske enheter 9,10,11,12,13, optiske enheter14,15,16, fenotypisk AST som kvantifiserer nukleinsyrekopien nummer17,18 og Raman-spektroskopiske metoder 19, 20,21,22,23,24. Disse metodene reduserer tiden for å veilede AST-resultater, men de fleste av dem gjelder bare for bakterielle isolater, ikke direkte til kliniske prøver, og krever fortsatt langvarig preinkubasjon.
I dette arbeidet presenterer vi en metode for rask bestemmelse av følsomheten til bakterier i urin og fullblod via overvåking av den cellulære metabolske aktiviteten ved SRS-avbildning. Vann (H2O) deltar i de aller fleste essensielle biomolekylære synteseprosesser i levende celler. Som en isotopolog av vann, gjennom enzymkatalysert H / D-utvekslingsreaksjon mellom det redoksaktive hydrogenatomet i NADPH og D-atomet i D2O, kan deuterium inkorporeres i biomasse inne i en celle25,26. En deuterert fettsyresyntesereaksjon er mediert av deuterium merket NADPH. D2O-inkorporering i reaksjoner av aminosyrer (AA) resulterer i deuterert proteinproduksjon26 (figur 1). På denne måten kan de nylig syntetiserte C-D-bindingsholdige biomolekylene i enkeltmikrobielle celler brukes som en generell metabolsk aktivitetsmarkør som skal detekteres. For å lese ut de novo syntetiserte C-D-bindinger, er Raman-spektroskopi, et allsidig analytisk verktøy som gir spesifikk og kvantitativ kjemisk informasjon om biomolekyler, mye brukt til å bestemme antimikrobiell følsomhet og redusere testtiden betydelig til noen få timer27,28,29,30 . På grunn av den iboende lave effektiviteten til Raman-spredningsprosessen har den spontane Raman-spektroskopien imidlertid lav deteksjonsfølsomhet. Derfor er det utfordrende å oppnå bilderesultater i sanntid ved hjelp av spontan Raman-spektroskopi. Koherent Raman-spredning (CRS), inkludert sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimulert Raman-spredning (SRS), har nådd høy deteksjonsfølsomhet på grunn av det sammenhengende lysfeltet for å generere størrelsesordener større enn for spontan Raman-spektroskopi, og derved gjengir høyhastighets, spesifikk og kvantitativ kjemisk avbildning på enkeltcellenivå 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
Her, basert på vårt siste arbeid40, presenterer vi en protokoll for rask bestemmelse av metabolsk aktivitet og antimikrobiell følsomhet ved femtosekund SRS C-D-avbildning av D2O-inkorporering av bakterier i normalt medium, urin og fullblodsmiljø på enkeltcellenivå. Femtosekund SRS-avbildning gjør det mulig å overvåke enkeltcellemetabolismeinaktiveringskonsentrasjon (SC-MIC) mot antibiotika på enkeltbakterienivå innen 2,5 timer. SC-MIC-resultatene valideres ved standard MIC-test via buljongmikrodilusjon. Vår metode er anvendelig for å bestemme antimikrobiell følsomhet for bakterier urinveisinfeksjon (UTI) og blodbaneinfeksjon (BSI) patogener med mye redusert analysetid sammenlignet med konvensjonell metode, noe som åpner muligheten for rask fenotypisk ASAT i klinikken på enkeltcellenivå.
Rapid AST kan oppnås ved å vurdere responsen av bakteriell metabolsk aktivitet til antibiotikabehandling ved bruk av enkeltcellet SRS metabolsk avbildning innen 2,5 timer fra prøven til SC-MIC resultater. Responsen av bakteriell metabolsk aktivitet og antimikrobiell følsomhet kan detekteres ved å overvåke metabolsk inkorporering av D2O for biomolekylsyntese ved bruk av SRS-avbildning av C-D-bindinger. Siden vann er allestedsnærværende brukt i levende celler, gir SRS metabolsk avbildning en universell m…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01AI141439 til J.-X.C og M.S, og R35GM136223 til J.-X.C.
Acousto-optic modulation | Gooch&Housego | R15180-1.06-LTD | Modulating stokes laser beam |
Amoxicillin | Sigma Aldrich | A8523-5G | |
Bandpass filter | Chroma | HQ825/150m | Block the stokes laser beam before the photodiode |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016-100G | Cation adjustment |
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth | Fisher Scientific | B12322 | Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002542 | |
Cover Glasses | VWR | 16004-318 | |
Culture tube with snap cap | Fisher brand | 149569B | |
Daptomycin | Acros | A0386346 | |
Deuterium oxide | 151882 | Organic solvent to dissolve antibiotics | |
Deuterium oxide-d6 | Sigma Aldrich | 156914 | Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system |
Escherichia coli BW 25113 | The Coli Genetic Stock Center | 7636 | |
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher brand | 05-408-129 | |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G4918 | |
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters | Millipore-Sigma | SLSV025NB | pore size 5 µm |
ImageJ software | NIH | Version: 2.0.0-rc-69/1.52t | Image processing and analysis |
Incubating orbital shaker set at 37 °C | VWR | 97009-890 | |
Inoculation loop | Sigma | BR452201-1000EA | |
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | Model: insight X3 | Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | Demodulate the SRS signals |
Oil condenser | Olympus | U-AAC | NA 1.4 |
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) | American Type Culture Collection | ATCC 47085 | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | Detector |
Polypropylene conical tube 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
Polypropylene filters | Thermo Scientific | 726-2520 | pore size 0.2 µm |
Sterile petri dishes | Corning | 07-202-031 | |
Syringe 10 mL | Fisher brand | 14955459 | |
UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU 530 | Measuring optical density at wavelength of 600 nm |
Vortex mixer | VWR | 97043-562 | |
Water objective | Olympus | UPLANAPO/IR | 60×, NA 1.2 |