JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам методом стимулированной рамановской рассеянной визуализации включения дейтерия в одну бактерию

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Этот протокол представляет собой экспресс-тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) в течение 2,5 ч с помощью одноклеточной стимулированной комбинационной рассеянной визуализации метаболизмаD2O. Этот метод применяется к бактериям в моче или цельной кровяной среде, что является преобразующим для быстрого одноклеточного фенотипического АСТ в клинике.

Abstract

Чтобы замедлить и предотвратить распространение устойчивых к противомикробным препаратам инфекций, срочно необходимо быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) для количественного определения антимикробного воздействия на патогены. Обычно требуется несколько дней, чтобы завершить АСТ обычными методами, основанными на долгосрочной культуре, и они не работают непосредственно для клинических образцов. Здесь мы сообщаем о быстром методе АСТ, обеспечиваемом стимулированной рамановской рассеянием (SRS) визуализации метаболического включения оксида дейтерия (D2O). Метаболическое включениеD2Oв биомассу и ингибирование метаболической активности при воздействии антибиотиков на уровне одной бактерии контролируются с помощью визуализации SRS. Концентрация инактивации одноклеточного метаболизма (SC-MIC) бактерий при воздействии антибиотиков может быть получена в общей сложности через 2,5 ч пробоподготовки и обнаружения. Кроме того, этот быстрый метод АСТ непосредственно применим к бактериальным образцам в сложных биологических средах, таких как моча или цельная кровь. Метаболическая визуализация SRS дейтерия является преобразующей для быстрого одноклеточного фенотипического АСТ в клинике.

Introduction

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой растущую глобальную угрозу для эффективного лечения инфекционных заболеваний1. Прогнозируется, что УПП приведет к дополнительным 10 миллионам смертей в год и потере мирового ВВП в размере 100 триллионов долларов к 2050 году, если не будут приняты меры по борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактериями 1,2. Это подчеркивает настоятельную необходимость в быстрых и инновационных методах диагностики для тестирования чувствительности к антибиотикам (АСТ) инфекционных бактерий, чтобы замедлить появление устойчивых к антибиотикам бактерий и снизить связанный с этим уровень смертности3. Чтобы обеспечить наилучший возможный клинический результат, крайне важно ввести эффективную терапию в течение 24 ч. Однако современный метод золотого стандарта, такой как диффузия диска или метод разбавления бульона, обычно требует не менее 24 ч для процедуры предварительной инкубации для клинических образцов и дополнительных 16-24 ч для получения результатов минимальной ингибирующей концентрации (MIC). В целом, эти методы отнимают слишком много времени, чтобы направлять немедленное решение о лечении инфекционных заболеваний в клинике, что приводит к появлению и распространению устойчивости к противомикробным препаратам4.

Генотипические методы АСТ, такие как методы полимеразной цепной реакции (ПЦР)5, были разработаны для быстрого обнаружения. Такие методы измеряют специфические генетические последовательности резистентности, чтобы обеспечить быстрые результаты АСТ. Они не полагаются на трудоемкую клеточную культуру; однако тестируются только конкретные известные генетические последовательности с резистентностью. Поэтому его применение ограничивается различными видами бактерий или различными механизмами резистентности. Кроме того, они не могут предоставить результаты MIC для решенийтерапии 6,7. Кроме того, для преодоления этих ограничений разрабатываются новые фенотипические методы быстрого АСТ8, в том числе микрофлюидные устройства 9,10,11,12,13, оптические приборы 14,15,16, фенотипические АСТ, количественно оценивающие число копий нуклеиновых кислот 17,18, и рамановские спектроскопические методы19, 20,21,22,23,24. Эти методы сокращают время для получения результатов АСТ, однако большинство из них применимы только к бактериальным изолятам, а не непосредственно к клиническим образцам, и по-прежнему требуют длительной преинкубации.

В данной работе представлен метод быстрого определения восприимчивости бактерий в моче и цельной крови посредством мониторинга клеточной метаболической активности методом SRS-визуализации. Вода (H2O) принимает участие в подавляющем большинстве основных процессов биомолекулярного синтеза в живых клетках. В качестве изотополога воды, посредством катализируемой ферментами реакции обмена H/D между окислительно-восстановительным активным атомом водорода в NADPH и атомом D вD2O, дейтерий может быть включен в биомассу внутри ячейки25,26. Реакция синтеза дейтерированных жирных кислот опосредована дейтерием, меченым NADPH. ВключениеD2O в реакции аминокислот (АА) приводит к получению дейтерированного белка26 (фиг.1). Таким образом, вновь синтезированные биомолекулы, содержащие связь C-D, в отдельных микробных клетках могут быть использованы в качестве общего маркера метаболической активности для обнаружения. Для считывания de novo синтезированных C-D связей рамановская спектроскопия, универсальный аналитический инструмент, предоставляющий специфическую и количественную химическую информацию биомолекул, широко используется для определения чувствительности к противомикробным препаратам и значительно сокращает время тестирования до нескольких часов 27,28,29,30 . Однако из-за присущей ему низкой эффективности процесса рамановского рассеяния спонтанная рамановская спектроскопия обладает низкой чувствительностью обнаружения. Поэтому трудно получить результаты изображения в режиме реального времени с помощью спонтанной рамановской спектроскопии. Когерентное рамановское рассеяние (CRS), включая когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS), достигло высокой чувствительности обнаружения из-за когерентного светового поля, генерирующего порядки величины больше, чем у спонтанной рамановской спектроскопии, тем самым обеспечивая высокоскоростную, специфическую и количественную химическую визуализацию на уровне одной клетки 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Здесь, основываясь на нашей последней работе40, мы представляем протокол для быстрого определения метаболической активности и чувствительности к противомикробным препаратам путем фемтосекундной визуализации SRS C-D включения D2O бактерий в нормальную среду, мочу и цельную среду крови на уровне одной клетки. Фемтосекундная визуализация SRS облегчает мониторинг концентрации инактивации внутриклеточного метаболизма (SC-MIC) против антибиотиков на уровне одной бактерии в течение 2,5 ч. Результаты SC-MIC подтверждаются стандартным тестом MIC путем микроразбавления бульона. Наш метод применим для определения антимикробной восприимчивости бактерий к инфекции мочевыводящих путей (ИМП) и инфекции кровотока (БСИ) возбудителей с значительно уменьшенным временем анализа по сравнению с обычным методом, что открывает возможность быстрого фенотипического АСТ в клинике на одноклеточном уровне.

Protocol

Использование образцов крови человека соответствует руководящим принципам IRB Бостонского университета и Национальных институтов здравоохранения (NIH). В частности, образцы взяты из банка и полностью деидентифицированы. Эти образцы не считаются человеческими субъектами офисом институ…

Representative Results

Влияние инкубационного времени на инкорпорацию дейтерия измеряется спонтанной рамановской микроспектроскопией в области C-D (от 2070 до 2250 см-1) и C-H (от 2 800 до 3 100 см-1) (рисунок 4a). Покадровые одноклеточные рамановские спектры P. aeruginosa , культивируемые в среде,…

Discussion

Быстрый АСТ может быть получен путем оценки ответа бактериальной метаболической активности на лечение антибиотиками с использованием одноклеточной метаболической визуализации SRS в течение 2,5 ч от образца до результатов SC-MIC. Реакция бактериальной метаболической активности и антимик?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH R01AI141439 для J.-X.C и M.S, и R35GM136223 для J.-X.C.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
check_url/kr/62398?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image